Подготовка тунца внеклеточной матрицы микроэковранции для оценки Шванн клеток фенотип спецификации

Summary

Эта методология призвана проиллюстрировать механизмы, с помощью которых внеклеточные матричные сигналы, такие как жесткость субстрата, состав белка и морфология клеток регулируют фенотип клеток Шванн (SC).

Abstract

Травматические травмы периферической нервной системы (PNS) в настоящее время не имеют подходящего лечения, чтобы восстановить полное функциональное восстановление. Клетки Шванн (SCs), как основные глиальные клетки PNS, играют жизненно важную роль в содействии регенерации PNS путем dedifferentiating в регенеративного фенотипа клеток после травмы. Однако, dedifferentiated состояние SCs является сложной задачей для поддержания в течение периода времени, необходимого для регенерации и влияет на изменения в окружающих внеклеточной матрицы (ECM). Поэтому необходимо определить сложное взаимодействие между ОК и различными ECM для обеспечения сигналов регенеративного потенциала УК. Для решения этой проблемы была разработана стратегия, в рамках которой различные белки ECM были адсоргированны на тунецовый полидиметилсилоксан (PDMS), который обеспечивал платформу, на которой можно модулировать жесткость и состав белка. СК были посеяны на тунецовые субстраты и критические клеточные функции, представляющие динамику фенотипа SC были измерены. Чтобы проиллюстрировать взаимодействие между экспрессией белка SC и клеточной морфологией, различные плотности посева СК в дополнение к отдельным микроконтакт печатных клеточных моделей были использованы и характеризуется иммунофлуоресценции окрашивания и западной пятно. Результаты показали, что клетки с меньшей площадью распространения и более высокой степенью клеточного удлинения способствовали более высоким уровням регенеративных фенотипических маркеров SC. Эта методология не только начинает разгадывать значительную связь между ЭКМ и клеточной функцией ОК, но и содержит руководящие принципы для будущей оптимизации биоматериалов в периферическом ремонте нервов.

Introduction

Травмы периферической нервной системы (PNS) остаются серьезной клинической проблемой в здравоохранении, ставя под угрозу качество жизни пациентов и создавая значительное влияние через множество социально-экономических^{факторов 1,2}. Клетки Шванн (SC), как основные глиальные клетки в PNS, обеспечивают необходимые молекулярные и физические сигналы, чтобы вызвать регенерацию PNS и помощь в функциональном восстановлении в коротких травм разрыва. Это связано с замечательной способностью SCs dedifferentiate в “ремонт” фенотип клеток из миелиниации или Фенотип Remak³. Ремонт SC является отличительным фенотипом клеток несколькими способами. После травмы, SCs увеличить их скорость распространения путем повторного ввода клеточного цикла и начать выражение нескольких транскрипционых факторов для облегчения reinnervation. Эти факторы, такие как c-Jun и p75 NTR, регулируются в то время как миелинирующие маркеры SC, такие как миелин основной белок (MBP), являются вниз регулируется^4,5. Кроме того, УК изменить морфологию, чтобы стать удлиненными и выровнены друг с другом, чтобы сформировать Бюнгнер полосы по всей травмы сайта⁶. Это обеспечивает физический механизм наведения для аксонов, чтобы распространиться на правильную дистальную цель^7. Однако, несмотря на способность, которой обладают РК, содействовать регенерации нервов при коротких травмах, результат функционального восстановления остается плохим при тяжелых травмах. Отчасти это связано с потерей внеклеточной матрицы (ECM) наведения сигналов, а также неспособностью ОК поддерживать регенеративный фенотип в течение длительных периодов^{времени 8}.

Процесс регенерации нерва и восстановления тесно связаны с состоянием базальной ламины после травмы. Базальная ламина представляет собой слой ECM вокруг нерва, который облегчает руководство и обеспечивает ECM-связанные сигналы для аксонов и ОК в тех случаях, когда он остается нетронутым после травмы⁹. Состояние ECM и его способность доставить матрицы связаны сигналы к клеткам является жизненно важным и ранее были изучены в различных контекстах^{10,11,12,13,14}. Например, было показано, что жесткость ECM может направлять функции клеток, такие как пролиферация и дифференциация^11,,15,,16. Состав ECM может также привести к четкой клеточной реакции и регулировать поведение клеток, таких как миграция и дифференциация через внутриклеточные сигнальные пути^17,,18. Кроме того, морфология клеток, включая область распространения и клеточное удлинение, играет важную роль в регулировании функции и может регулироваться ECM-связанными сигналами^19,,20. Многие предыдущие исследования были сосредоточены на стволовых клеток дифференциации в определенных линий, но РК обладают аналогичной способностью изменять фенотип из гомеостатических, взрослых SC в здоровом нерве, чтобы ремонт SC способны выделять белки и факторы роста при реконструкции ECM после травмы нерва^5,21. Поэтому особенно важно определить механизмы, лежащие в основе взаимосвязи между врожденной регенеративной способностью SC и связанными ЭКМ сигналами для понимания, чтобы в конечном итоге использовать эту способность для регенерации нервов.

Для решения этой проблемы мы разработали подробную методологию для создания субстрата клеточной культуры, где механическая жесткость и тип лиганда могут быть легко настроены в физиологически соответствующих диапазонах. Polydimethyl siloxane (PDMS) был выбран в качестве субстрата из-за его высокой тунецовой механики по сравнению с полиакриламидным гелем, где максимальный модуль Янг составляет около 12 кПа контрастирует с PDMS около 1000 kPa^22,23,24. Это полезно для работы под рукой, так как недавние исследования показали, что модули Янга седалищного нерва может превышать 50 кПа во время разработки, тем самым предполагая, что диапазон жесткости нервов в PNS шире, чем ранее изучены. Различные белки способны адсорбции на субстраты PDMS для анализа комбинаторной регуляции механики и лигандов на поведение SC. Это позволяет исследовать несколько микроокрументальных сигналов, присутствующих в процессе регенерации PNS, и сравнить высокую степень настраиваемости с работой, фокусясь исключительно на жесткости субстрата^25. Кроме того, эти инженерии субстратов клеточной культуры совместимы с множеством методов количественного анализа, таких как иммуногистохимия, западная помарка, и количественная полимеразная цепная реакция (q-PCR).

Эта разработанная платформа клеточной культуры очень подходит для анализа механистических путей из-за высокого уровня индивидуальной настройки каждого сигнала, связанного с ECM. Кроме того, популярные методы микропаттернирования клеток, в том числе микроконтактная печать, могут быть достигнуты на субстратах, чтобы позволить для контролируемой клеточной адгезии для анализа формы клеток по отношению к другим ECM связанных сигналов²⁴. Это имеет решающее значение, поскольку линейные узорчатые субстраты, которые способствуют удлинению популяций клеток, служат инструментом для имитации и изучения удлиненной и регенеративной ОБЛАСТИ в диапазонах Бюнгнера во время регенерации нервов. Кроме того, клеточная морфология является мощным регулятором нескольких функций клеток и потенциально может ввести смешанные экспериментальные^{результаты,}если не контролируется²⁶,²⁷. Значительное внимание в настоящее время уделяется механизмам, регулирующим SC регенеративного фенотипа, регулируемых ECM сигналы^28,29,30. Это необходимо для того, чтобы дать представление о дизайне биоматериалов, которые могут быть применены в качестве нервных каналов для помощи в регенерации нервов PNS. Эти подробные протоколы в конечном счете могут быть применены в качестве потенциального инструмента для расшифровки механизмов SC и других функций типа клеток, регулируемых ECM связаны сигналы.

Protocol

1. Подготовка и характеристика субстрата культуры тунецовой культуры Подготовка субстрата Смешайте основу PDMS elastomer и отбиваете агенты, энергично разъездяйте наконечник пипетки в соотношении между 10:1 и 60:1 до тех пор, пока пузырьки не будут однородно рассеяны внутри ?…

Representative Results

Для анализа и количественной оценки взаимодействия между жесткостью субстрата и составом белка на фенотипе SC был разработан субстрат клеточной культуры ОММС(рисунок 1A). Сжатие тестирования полимера на различной базе: лечение агентов отношения были использованы для ко…

Discussion

SCs может способствовать регенерации нерва из-за их фенотипической трансформации и регенеративного потенциала после повреждения нерва. Однако, как ECM сигналы регулируют этот регенеративный потенциал остается в основном неясным, потенциально препятствуя не только развитие биоматериал…

Materials

Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate	Thermo Fisher Scientific	A23017	BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7076S	Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074S	Antibody used for western blot analysis
BrdU	Thermo Fisher Scientific	B23151	Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	B35130	Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01	Protein used to coat coverslips
Compression force test machine	TestResources		Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	Cell culture medium
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	Cell culture medium supplemental
Fibronectin	Thermo Fisher Scientific	33010-018	Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti2	Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Fisher Scientific	78440	Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015	Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36971	Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody	Thermo Fisher Scientific	711202	Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody	Cell Signaling Technology	3700S	Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010	KAYAKU	SU8-2010	Photoresist
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P-2443	Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody	Cell Signaling Technology	9165S	Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody	Abcam	ab40390	Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody	Cell Signaling Technology	8238S	Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin	Thermo Fisher Scientific	R415	Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer	Abcam	ab156034	Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line	ATCC	CRL-2768	Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent	Sigma Aldrich	761036	Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	15090-046	Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner	Novascan		Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x)	Thermo Fisher Scientific	15040066	Cell dissociation reagent