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Bioengineering

シュワン細胞表現型仕様を評価するための細胞外マトリックス微小環境の調製

Published: June 02, 2020
doi:
10.3791/61496
, ,
1Department of Chemical and Environmental Engineering,University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering,University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program,University of Cincinnati College of Medicine

Summary

この方法論は、基質剛性、タンパク質組成および細胞形態などの細胞外マトリックスの手掛かりがシュワン細胞(SC)表現型を調節するメカニズムを示すことを目的とする。

Abstract

外傷性末梢神経系(PNS)の傷害は現在、完全な機能的回復を取り戻すための適切な治療法を欠いている。シュワン細胞(SC)は、PNSの主要なグリア細胞として、損傷後の再生細胞表現型に脱分化することによってPNS再生を促進する上で重要な役割を果たす。しかし、SCの分化状態は、再生に必要な期間を通じて維持することが困難であり、周囲の細胞外マトリックス(ECM)の変化の影響を受けます。したがって、SCと異なるECMの間の複雑な相互作用を決定して、SCの再生電位の手掛かりを提供することが不可欠である。これに対処するために、異なるECMタンパク質を調整可能なポリジメチルシロキサン(PDMS)基質に吸着させ、剛性およびタンパク質組成を変調できるプラットフォームを提供する戦略が作成されました。SCをチューナブル基材に播種し、SC表現型のダイナミクスを表す重要な細胞機能を測定した。SCタンパク質発現と細胞形態との相互作用を例示するために、個別のマイクロコンタクト印刷細胞パターンに加えてSCの異なる播種密度が利用され、免疫蛍光染色およびウェスタンブロットによって特徴付けられていた。結果は、より小さな広がり領域を有し、細胞伸びの範囲が高い細胞がSC再生表現性マーカーのより高いレベルを促進することを示した。この方法論は、SCのECMと細胞機能の重要な関係を解明し始めるだけでなく、末梢神経修復における生体材料の将来の最適化のためのガイドラインを提供する。

Introduction

末梢神経系(PNS)傷害は、患者の生活の質を損ない、社会経済的要因11,22を通じて重大な影響を及ぼす医療における主要な臨床的課題であり続ける。シュワン細胞(SC)は、PNSの主要なグリア細胞として、PNS再生を誘導し、短いギャップ傷害における機能的回復を助けるために必要な分子および物理的手がかりを提供する。これは、SCがミエリン化またはレマク表現型3から「修復」細胞表現型に分解する顕著な能力によるものである。修復SCは、いくつかの点で特徴的な細胞表現型である。傷害後、SCは細胞周期に再入することによって増殖速度を増加させ、再活性化を容易にするためにいくつかの転写因子の発現を開始する。c-Junやp75 NTRなどのこれらの要因は、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)などのSCマーカーを下方制御する一,方でアップレギュレートされる。さらに、SCは形態を変化させ、細長くなり、互いに整列して傷害部位6を横切ってブンナーバンドを形成する。これは、軸索が正しい遠位ターゲット7まで拡張するための物理的なガイダンスメカニズムを提供します。しかし、SCが短いギャップ傷害で神経再生を促進する能力を有しているにもかかわらず、機能的回復の結果は重度の傷害において依然として悪いままである。これは、細胞外マトリックス(ECM)誘導の喪失、ならびにSCが長期間にわたって回生表現型を維持できないことに起因する8。

神経の再生および回復プロセスは、損傷後の基底層層の状態と密接に結びついている。基底層ラミナは、指導を容易にし、損傷後に無傷のままである場合に軸索およびSCにECMバウンドキューを提供する神経の周りのECMの層である9。ECMの状態とセルに行列結合キューを提供する能力は非常に重要であり、以前は,10、11、12、13、14のさまざまな異なるコンテキストで探求されてきました。10,11,12,1314例えば、ECMの剛性が増殖や分化,11、15、16,15などの細胞機能を導くことができることが示されている。16ECMの組成はまた、明確な細胞応答を導き、細胞内シグナル伝達経路17、18,18を介した移動および分化などの細胞行動を調節することができる。さらに、細胞形態は、広域および細胞伸長を含む、機能を調節する上で大きな役割を果たし、ECM結合キュー19、20,20によって支配することができる。多くの以前の研究は、定義された系統に分化する幹細胞に焦点を当ててきましたが、SCは健康な神経内の恒常性の成人SCから、神経損傷55、2121に続くECMを再モデリングしながらタンパク質および成長因子を分泌することができる修復SCに表現型を変更する同様の能力を有する。したがって、神経再生のためにこの能力を最終的に活用するための洞察のために、先天的なSC再生能力とECMバウンドキューとの関係の根底にあるメカニズムを特定することが特に重要です。

これに対処するために、我々は、機械的剛性およびリガンドタイプが生理学的に関連する範囲で容易に調整できる細胞培養基質を生成するための詳細な方法論を開発した。ポリジメチルシロキサン(PDMS)は、ポリアクリルアミドゲルと比較して、その高度に調整可能な力学のために基材として選ばれました, 最大ヤング率は約12 kPaでPDMSと対比する約12 kPa22,,23,,24.これは、最近の研究では、発達中にウサギ坐骨神経のヤング率が50kPaを超えることができ、それによってPNS内の神経の剛性の範囲が以前に調べられたよりも広いことを示唆しているので、目の前の仕事に有益である。異なるタンパク質は、SC挙動上の力学とリガンドの組み合わせ調節を分析するためにPDMS基質に吸着することが可能です。これにより、PNS再生プロセスに存在する複数の微小環境手掛かりの調査と、基板25の剛性のみに焦点を当てた作業に対する高度なタンナビリティの比較を可能にする。また、これらの操作細胞培養基質は、免疫物質化学、ウェスタンブロット、定量ポリメラーゼ連鎖反応(q-PCR)などの多くの定量分析方法と互換性がある。

この工学的細胞培養プラットフォームは、各ECM結合信号の個々のタンナビリティの高いレベルに起因する機械経路の解析に非常に適しています。また、マイクロコンタクト印刷を含む細胞マイクロパターニングの一般的な方法は、他のECM結合キュー24に関連して細胞形状を解析する制御された細胞接着を可能にする基質上で達成することができる。これは、細胞集団の伸びを促進する線パターン化基質が、神経再生中にビュンナーバンド内の細長く再生的なSCを模倣し、研究するためのツールを提供するため、非常に重要です。また、細胞形態は複数の細胞機能の強力な調節因子であり、制御されない場合には交和実験結果を導入する可能性がある26,27。26,,ECM キュー28、 29、2930によって制御される SC 回生表現型を制御するメカニズムに、重要な注意が提供されています。これは、PNS神経再生の補助のための神経誘導導管として適用することができる生体材料の設計に関する洞察を提供するために不可欠です。これらの詳細なプロトコルは、最終的には、ECMバインドキューによって規制されるSCおよび他の細胞タイプの機能のメカニズムを解読する潜在的なツールとして適用することができる。

Protocol

1. チューナブル細胞培養基質の調製と特性評価 基板調製 PDMSベースエラストマーと硬化剤を、10:1~60:1の比率でピペットチップを使用して、気泡が混合物内に均質に分散するまで激しく混合します。気泡が消散するまで真空乾燥を使用して気泡を除去します。注:PDMS重合の間、硬化剤は、最終的なポリマー所望の機械的特性を提供するために、基エラストマーと架…

Representative Results

SC表現型上の基質剛性とタンパク質組成との相互作用を分析・定量化するために、調整可能なPDMS細胞培養基質を開発した(図1A)。異なる塩基におけるポリマーの圧縮試験:硬化剤比は、基材のヤング率(E)を定量するために利用された(図1B)。得られたモジュラス値の範囲は、生理学的に関連する基質条件を表す。基質の調製後、SCを培養し、チューナ?…

Discussion

SCは、その表現型の変換と神経損傷後の再生可能性のために神経再生を促進することができます。しかし、ECMキューがこの再生能力をどのように調節するのかはほとんど不明であり、神経再生を促進することを目的とした生体材料の開発だけでなく、神経再生に関与するメカニズムの理解を妨げる可能性がある。この相互作用を検討するために、細胞培養基質は、剛性、タンパク質コーティ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、シンシナティ大学からの資金援助を感謝して認めている。著者らはまた、シンシナティ大学先端材料特性評価研究所のロン・フレニケンの支援に感謝する。

Materials

Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate Thermo Fisher Scientific A23017 BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Antibody used for western blot analysis
BrdU Thermo Fisher Scientific B23151 Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific B35130 Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 Protein used to coat coverslips
Compression force test machine TestResources Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965092 Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 Cell culture medium supplemental
Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010-018 Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti2 Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78440 Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015 Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI Thermo Fisher Scientific P36971 Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody Thermo Fisher Scientific 711202 Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody Cell Signaling Technology 3700S Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010 KAYAKU SU8-2010 Photoresist
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P-2443 Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody Cell Signaling Technology 9165S Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody Abcam ab40390 Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody Cell Signaling Technology 8238S Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer Abcam ab156034 Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line ATCC CRL-2768 Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent Sigma Aldrich 761036 Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin Thermo Fisher Scientific 15090-046 Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner Novascan Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x) Thermo Fisher Scientific 15040066 Cell dissociation reagent
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References

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33 (2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37 (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24 (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3 (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7 (4), 335 (2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25 (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247 (2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. , (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9 (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8 (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065 (2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46 (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308 (2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9 (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337 (2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior – Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engineering. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).

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Extracellular MatrixMicroenvironmentSchwann CellCell PhenotypePDMSMicrocontact PrintingSubstrate StiffnessProtein CompositionCell MorphologyNervous System RegenerationCell Culture Platform
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Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).
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