Summary
Een protocol om de microsporidische parasiet Edhazardia aediste cultuuren. De parasiet wordt doorgevoerd van de ene generatie Aedes aegypti muggen naar de volgende via horizontale overdracht in het larvestadium, gevolgd door verticale transmissie in het volwassen stadium. Levende sporoplasma's overleven op lange termijn in geïnfecteerde eieren.
Abstract
Edhazardia aedis is een microsporidische parasiet van Aedes aegypti muggen, een ziektevector die meerdere arbovirussen overbrengt die jaarlijks miljoenen ziektegevallen veroorzaken. E. aedis veroorzaakt sterfte en verminderde reproductieve geschiktheid in de muggenvector en is onderzocht op zijn potentieel als biocontrolemiddel. Het protocol dat we presenteren voor het kweken van E. aedis is gebaseerd op de natuurlijke infectiecyclus, die zowel horizontale als verticale transmissie in verschillende levensfasen van de muggenhost omvat. Ae. aegypti muggen worden blootgesteld aan sporen in het larvale stadium. Deze geïnfecteerde larven rijpen vervolgens in volwassenen en zenden de parasiet verticaal over naar hun nakomelingen. Geïnfecteerde nakomelingen worden vervolgens gebruikt als een bron van sporen voor toekomstige horizontale transmissie. Culturing E. aedis kan een uitdaging zijn voor de niet-ingewijden gezien de complexiteit van de levenscyclus van de parasiet, en dit protocol biedt gedetailleerde begeleiding en visuele hulpmiddelen voor verduidelijking.
Introduction
Aedes aegypti is de muggenvector van meerdere arbovirussen (bijvoorbeeld dengue, Zika, gele koorts) die samen naar schatting honderden miljoenen ziektegevallen per jaar en meer dan 30.000 sterfgevallen1,2. De behandeling van ziekten veroorzaakt door deze ziekteverwekkers is beperkt tot ondersteunende zorg en het is waarschijnlijk dat er in de toekomst nog meer arbovirussen zullen ontstaan3. Controle van de muggenvector is daarom van primair belang, omdat het effectief voorkomt dat de overdracht van huidige en opkomende ziekteverwekkers4. Traditioneel, vector controle strategieën voornamelijk gebruik maken van chemische insecticiden, maar resistentie tegen veelgebruikte insecticiden heeft gedreven de vraag naar nieuwe methoden van vectorcontrole. Een potentieel middel dat is onderzocht voor zijn biocontrole-eigenschappen tegen Ae. aegypti is de parasiet Edhazardia aedis5,6.
E. aedis, voor het eerst geïdentificeerd als Nosema aedis door Kudo in 1930, is een microsporidische parasiet van Ae. aegypti muggen7. De ontwikkeling en reproductie van E. aedis is relatief complex en de levenscyclus ervan kan op meerdere manierenverlopen 7,8,9. Een gemeenschappelijke ontwikkelingscyclus wordt in de diepte beschreven in Becnel et al., 19897 en wordt gebruikt voor laboratoriumvermeerdering (figuur 1)8. Kortom, de cyclus begint wanneer Ae. aegypti eieren verticaal besmet met E. aedis uitkomen in geïnfecteerde larven die onoplosbare sporen in het vetlichaam ontwikkelen, en meestal sterven als larven of poppen. Onoplosbare sporen die vrijkomen uit dode larven vervuilen de habitat en worden ingenomen door gezonde Ae. aegypti larven. Deze sporen ontkiemen voornamelijk in het spijsverteringskanaal, infecteren spijsverteringsweefsel van de blootgestelde larven, wat resulteert in horizontale overdracht. Horizontaal geïnfecteerde larven ontwikkelen zich tot volwassenen (ouderlijke generatie) waar binucleate sporen worden gevormd. Bij het vrouwtje, deze binucleate sporen binnenvallen het voortplantingskanaal en hun bijbehorende sporoplasma infecteert het ontwikkelen van eicellen. Deze eieren komen vervolgens uit in geïnfecteerde larven (kinderlijke generatie), wat resulteert in verticale overdracht van de parasiet en voortzetting van de cyclus zoals hierboven beschreven.
Meerdere studies hebben onderzocht het potentieel van E. aedis voor biocontrol. Infectie met E. aedis is aangetoond dat resulteren in verminderde voortplantingscapaciteit van Ae. aegypti vrouwtjes10. Verder, in een semi-veld experiment, inundative release van E. aedis resulteerde in de totale uitroeiing van een test Ae. aegypti bevolking gehouden binnen een gescreende behuizing6. Hoewel E. aedis in staat is om een aantal ontwikkelingsstadia te ondergaan in een diverse reeks muggensoorten, wordt deze slechts verticaal overgedragen in Ae. aegypti, wat wijst op een hoge mate van gastheerspecificiteit11,12. Evenzo heeft de microsporidische parasiet in een laboratoriumbeoordeling van het potentiële milieurisico in verband met E. aedisniet infecteerde om niet-doelinaalfauna te infecteren, waaronder roofdieren die Ae. aegyptilarven inlikten die besmet waren met E. aedis13. Deze resultaten benadrukken het potentieel voor E. aedis te worden gebruikt in biologische bestrijding strategieën gericht op natuurlijke Ae. aegypti populaties.
Ondanks het feit dat E. aedis belofte toont voor gebruik in vectorcontrole, zijn er uitdagingen om het op grote schaal te kweken en in te zetten. E. aedissporen verliezen infectiviteit in minder dan één dag bij koude temperaturen (d.w.z. 5 °C). Zelfs bij warmere temperaturen (d.w.z. 25 °C) verliezen sporen snel infectiviteit in de loop van drie weken14. Bovendien moet E. aedis worden gekweekt in levende Ae. aegypti muggen en gecontroleerde doseren van gezonde larve muggen is noodzakelijk om de voltooiing van de levenscyclus te waarborgen en om instorting van de bevolking die wordt gebruikt voor cultuur8te voorkomen. De eis van in vivo culturing vormt een uitdaging; recente ontwikkelingen op het gebied van muggenmassateelt en robotica (bijvoorbeeld Massaro et al.15)zouden echter grootschalige generatie E. aedissporen mogelijk kunnen maken. We verwachten dat visualisatie van deze methodologie de toegankelijkheid van het E. aedis-opfoupsprotocol zal vergroten en meer onderzoekers in staat zal stellen de basisbiologie en het toegepaste potentieel van dit systeem te onderzoeken. We verwachten ook dat het zal vergemakkelijken meer samenwerkingen met ingenieurs, robotici, en de bredere technologiesector, die kan dienen om de massa opfokking van E. aediste verbeteren .
Figuur 1: E. aedis propagatie in Ae. aegypti. Voortplanting van E. aedis begint met het uitkomen van E. aedis geïnfecteerde eieren. Geïnfecteerde larven worden gekweekt tot4e instar, E. aedis sporen worden geïsoleerd van deze larven, en de sporen worden gebruikt om oraal infecteren gezonde2 nd/3rd instar larven gefokt uit een niet-geïnfecteerde koppeling van eieren (horizontale transmissie). Deze oraal geïnfecteerde larven worden vervolgens gekweekt tot volwassenheid (ouderlijke generatie) en leggen eieren besmet met E. aedis (verticale overdracht). Geïnfecteerde eieren (kinderlijke generatie) worden vervolgens uitgebroed om de infectiecyclus en parasietencultuur voort te zetten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Protocol
1. Dag 0
- Hatch Ae. aegypti eieren besmet met E. aedis door het plaatsen in larve opfok lade met 1 L gedeïoniseerd (DI) water. Voeg 50 mg visvoer toe.
OPMERKING: Op het moment van publicatie is een laboratoriumstam van E. aedis alleen verkrijgbaar bij laboratoria die actief onderzoek doen naar de parasiet, omdat E. aedis niet vatbaar is voor langdurige opslag en geïnfecteerde eieren momenteel niet in opslagplaatsen worden opgeslagen. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het werken met E. aedis kunnen contact opnemen met de desbetreffende auteur om geïnfecteerde eieren aan te vragen.
OPMERKING: Het uitkomen van grote aantallen besmette eieren is over het algemeen niet nodig; ten E. aedis geïnfecteerde Ae. aegypti larven zijn voldoende om ≥ 1000 gezonde larven te doseren.
OPMERKING: Voor alle delen van dit protocol hebben we muggen ondergebracht onder de volgende omstandigheden: 14 uur/10 uur licht/ donkere cyclus, 27 °C temperatuur en 80% relatieve vochtigheid.
2. Dag 1
- Na het uitkomen, vermindering van de dichtheid van larven tot ~ 100 larven per lade, het maken van nieuwe trays als dat nodig is (ook met 1 L DI water).
- Voeg een stuk droog kattenvoer toe aan elke lade. Vul voedsel aan wanneer het uitgeput is, maar zorg niet voor een overmaat aan voedsel. Een stuk kattenvoer (~ 200 mg) om de drie dagen is voldoende.
OPMERKING: Pas de hoeveelheid voedsel aan afhankelijk van de specifieke opfokomstandigheden (d.w.z. voedsel verminderen als water troebel wordt of larven sterven, verhoog voedsel als larven ernstig worden vertraagd in ontwikkeling). Andere voedingsregimes en/of opfoekens omstandigheden dan hier voorgesteld kunnen worden gebruikt, maar aanpassingen van de timing van dit standaardprotocol kunnen nodig zijn.
3. Dag 4\u20125
- Wanneer geïnfecteerde larven zijn 3e – 4e instars, broed gezond / niet-geïnfecteerde Ae. aegypti eieren in een nieuwe lade.
- Achter bij dichtheden zodanig dat gezonde Ae. aegypti bereiken2e - 3e instar in 48-72 h. In onze handen kan dit worden bereikt met behulp van dichtheden van 200\u2012300 larven per 1 L water met ad libitum toegang tot voedsel. Broedpartijen van gezonde eieren gedurende meerdere dagen kunnen garanderen dat larven zich in het juiste stadium bevinden wanneer dat nodig is.
4. Dag 7\u20128: Horizontale transmissie
OPMERKING: Doseren van gezonde larven met E. aedis kan niet worden uitgevoerd totdat onoplosbaar sporen bij hoge aantallen zijn bij geïnfecteerde larven (1 x 104 – 1 x 106 per larve). Dit gebeurt laat in de4e instar fase (Figuur 2).
- Sporen oogsten en kwantificeren.
- Gebruik een transferpipet (men kan de punt tot een bredere diameter moeten snijden) om 10 geïnfecteerde larven naar een 1,5 mL microcentrifugebuis te verplaatsen.
- Verwijder kweekwater met een transfer pipet en was een keer door het toevoegen van ~ 1 mL van schoon DI water. Verwijder het waswater met een pipet, voeg 500 μL schoon DI-water toe aan de 10 larven en homogeniseer met behulp van een stamper en mechanische homogenisator.
- Kwantificeer sporen met behulp van een hemocytometer bij 400x vergroting.
OPMERKING: Niet-ucleate sporen kunnen worden geïdentificeerd aan de gedektheid (d.w.z. perenvorm; Figuur 2A).
- Dosis gezonde Ae. aegypti larven met E. aedis.
- Maak verse larve voedseldrijfmest door het mengen van 1,2 g leverpoeder, 0,8 g biergist en 100 mL water.
LET OP: Voedsel hoeft niet vers te zijn als het autoclaved is en opgeslagen bij 4 °C tot gebruik. - Breng 100 2- 3e instar gezonde Ae. aegypti larven in 150 mL bekers of specimen kopjes.
- Doseer elk bekerglas van 100 larven met 5 x 104 – 1 x 105 sporen.
- Voeg 2 mL larve voedseldrijfmest en DI-water toe aan een eindvolume van 100 mL.
- Maak verse larve voedseldrijfmest door het mengen van 1,2 g leverpoeder, 0,8 g biergist en 100 mL water.
- Na 12-24 uur blootstelling, breng blootgestelde larven in het grootbrengen van trays en achter naar de volwassenheid volgens een standaard opfokprotocol16.
5. Toezicht en verticale transmissie
- Monitor gesedoedeerde larven voor verpoppen en breng poppen over naar een opkomstbeker in een kooi. Suikervoervolwassenen ad libitum (per16,17). Eclosing volwassenen zullen worden besmet door E. aedis.
- Bloedvoeren volwassenen (per16,17) en het verzamelen van eieren. Verticale overdracht van E. aedis vindt plaats bij deze stap.
OPMERKING: Als er extra bloedmaaltijden worden verstrekt zodra de ovipositie is voltooid, kunnen vrouwtjes ten minste één extra koppeling van eieren leggen voordat volwassenen (vaak plotselinge) hoge sterfteniveaus lijden. - Gebruik deze Ae. aegypti eieren besmet met E. aedis om door te gaan voortplanting te beginnen met stap 1 van dit protocol.
LET OP: Eieren kunnen worden opgeslagen voor 2 – 3 maanden onder de juiste omstandigheden16. - Reinig alle materialen die in contact kwamen met E. aedis met 10% bleekmiddel en autoclaving (indien mogelijk) om besmetting te voorkomen.
Representative Results
E. aedis besmette Ae. aegypti Liverpool (LVP1b12) eieren werden uitgebroed zoals beschreven in het protocol hierboven. In de4e instar stadium, visuele tekenen van infectie kan worden waargenomen, met inbegrip van witte sporen cysten in de vetlichamen van geïnfecteerde larven (een voorbeeld van dit fenotype wordt weergegeven in figuur 2B). Onoplosbare sporen werden geoogst van4e instar larven door het homogeniseren van 10 larven in 500 μL DI water. Deze sporen waren pyriform (peervormig) en gemakkelijk zichtbaar bij 400x (figuur 2A). Met behulp van een hemocytometer werd een sporentelling van 4,05 x 103 sporen/μL berekend. Honderd gezonde Ae. aegypti larven werden vervolgens horizontaal besmet met ~ 50.000 sporen in 100 mL water voor een laatste dosis ~ 500 sporen / larve. Larven werden opgevoed tot volwassenheid (ouderlijke generatie) en bloed gevoed met gedefibrineerd konijnenbloed plus 1% (v/v) 100 mM adenosine struismiddel. Verticaal geïnfecteerde eieren werden verzameld (kinderlijke generatie) en uitgebroed om E. aedis voortplanting voort te zetten en om infectie succes te kwantificeren.
Na zeven dagen na het uitkomen werden 25 larven van de kinderlijke generatie overgebracht naar individuele 1,5 mL microcentrifugebuizen en eenmaal gewassen met DI-water. Individuele larven werden gehomogeniseerd in 250 μL di water- en infectiestatus en E. aedis-belastingen werden beoordeeld met behulp van een hemocytometer. Verticale infectie percentage van E. aedis in de filiale generatie bleek te zijn 96% en de gemiddelde sporenbelasting van geïnfecteerde personen op zeven dagen na het uitkomen was 3,31 x 105 (Bereik: 3,25 x 104 – 1,47 x 106; Figuur 3).
Figuur 2: Visualisatie van E. aedis-infectie bij Ae. aegypti-muggen. a) E. aedis niet-ucleate pyriforme sporen. Tien E. aedis besmet 4e instar larven werden gehomogeniseerd in 500 μL di water ongeveer zeven dagen na het uitkomen. 10 μL van het homogenaat werd op een hemocytometer geladen en bekeken bij 400X. Rode pijlen geven representatieve niet-inspuiten E. aedis sporen. (B) E. aedis besmet4e instar larven ontwikkelen onderscheidende witte sporen cysten in hun vetlichaam18. Ze hebben ook vaak misvormde en opgezwollen buiksegmenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Cultuur protocol leidt tot effectieve E. aedis infectie in de filiale generatie. Ae. aegypti larven (n = 25) van de kinderlijke generatie werden individueel gehomogeniseerd in 250 μL DI water en 10 μL van het homogenaat werd op een hemocytometer geladen. Aanwezigheid van niet-ucleate sporen wees op een positieve infectie en sporen werden gekwantificeerd voor alle positieve monsters. (A) Prevalentie van infectie onder kinderlijke larven. Grijs komt overeen met niet-geïnfecteerde larven, en zwart tot besmet. Getallen die op elk segment worden weergegeven, geven de absolute telling van individuen in elke groep. (B) Spore belasting voor elk besmet individu. Zwarte stippen vertegenwoordigen hetlogboek 10 getransformeerde onopgeïnteerlingen tellen voor elke larve. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
We presenteren hier de methode oorspronkelijk beschreven in Hembree en Ryan, 19828 voor het grootbrengen van E. aedis microsporidia in Ae. aegypti muggen. De stam van E. aedis gebruikt in deze studie werd afgeleid van de oorspronkelijke veld collectie door Stephen Hembree in Thailand in 197919. De methode speelt in op horizontale transmissie, die van nature voorkomt in de transmissiecyclus van E. aedis7, om de parasiet op een gecontroleerde manier te verspreiden. Deze methode kan een uitdaging zijn voor nieuwkomers die niet bekend zijn met het verschijnen van sporen, symptomen van infectie bij larven of de coördinatie die nodig is om het multi-stage opfoktings- /dosingprotocol met succes te voltooien. Onze hoop is dat de visuele hulpmiddelen die dit protocol begeleiden de toetredingsdrempels voor onderzoekers die E. aedis willen cultuuren, zullen verminderen.
We propageerden E. aedis in Ae. aegypti zoals hierboven beschreven en kwantificeerden het succes van parasitisme in de kinderlijke generatie. Kortom, we uitgebroed E. aedis geïnfecteerde Ae. aegypti eieren, fokte ze tot 4e instar, en verzamelde onopbrengen E. aedis sporen van de geïnfecteerde larven. Vervolgens hebben we via orale inname gezonde larven horizontaal besmet met deze sporen en de horizontaal geïnfecteerde larven tot volwassenheid opgevoed. We bloed gevoed de geïnfecteerde volwassenen (ouderlijke generatie) en verzamelde eieren (kinderlijke generatie), die we verondersteld zou verticaal besmet zijn met de E. aedis parasiet. We broedden eieren uit de kinderlijke generatie en verzamelden en homogeniseerden een subset van de larven toen ze4e instars waren. We kwantificeerden het percentage larven dat besmet was met E. aedis en de totale sporentelling bij alle geïnfecteerde individuen. We ontdekten dat de overgrote meerderheid (96%) van individuen waren besmet en de gemiddelde sporenbelasting van geïnfecteerde larven was ~105. We concluderen dat ons opfokprotocol resulteerde in een zeer succesvolle voortplanting van E. aedis in Ae. aegypti muggen.
Er zijn meerdere aspecten van dit protocol die bijzonder uitdagend kunnen zijn voor de niet-ingewijde gebruiker. Hieronder bieden we enkele aanvullende informatie die van nut kan zijn. Voor vragen over algemene muggenhouderij valt een complete gids voor het onderhoud van de Aegypti-kolonie buiten het toepassingsgebied van dit protocol. Echter, veel voorkomende vragen kunnen worden aangepakt door middelen uit de Biodefense en Emerging Infections Research Resources Repository16,17 met inbegrip van eierbroedsel, algemene dieetbehoeften, huisvesting en milieuomstandigheden, en bloedvoeding. Met betrekking tot de tijdlijn van infectie vertonen larven die uit geïnfecteerde eieren zijn voortgekomen pas laat in het4e instar-stadium tekenen van infectie. Onoplosbaar sporen verschijnen snel, in de loop van 1-2 dagen. Larven kunnen vrijwel niet besmet lijken na 6 dagen na het uitkomen, maar zeer besmet door dag 7 of 8 na het uitkomen. Bovendien kan het een uitdaging zijn om sporen in gehomogeniseerde monsters te visualiseren, omdat er veel andere microben aanwezig zijn in hele muggenhomogenaten, waaronder andere eukaryotische eencellige organismen (bijvoorbeeld gist) van dezelfde grootte als de E. aedis niet-ucleïteitsporen. De kenmerkende vorm van E. aedis sporen (Figuur 2A) is een zeer betrouwbare methode voor identificatie en zal helpen onderscheiden E. aedis van andere microben in het homogenaat. Hoewel het niet nodig is voor identificatie of kwantificering, kan het, indien sporezuivering gewenst is, worden bereikt via colloïdale silicadichtheidsgraadcentrifugatie die het mogelijk maakt E. aedissporen te scheiden van andere vervuilende elementen in het homogenaat. Dit proces wordt in detail beschreven in Solter et al.20.
Temperatuur en dieet gebruikt in het fokken praktijken vaak verschillen tussen laboratoria, maar variaties zal waarschijnlijk nog steeds opleveren succesvolle parasiet voortplanting. Kleine verschillen in larve voedseltype interfereren niet met succesvolle infectie, hoewel we in dit protocol niet expliciet verschillende voedselsoorten hebben getest. Het effect van temperatuur op infectie is getest en E. aedis infectie bleek robuust te zijn bij een breed scala van temperaturen21. De maximale sporeproductie vond plaats bij 30,8 °C, maar was nog steeds robuust bij opfoktemperaturen van slechts 20 °C. Het aantal sporen werd drastisch verminderd bij hogere opfoktemperaturen (36 °C), daarom moeten deze temperaturen voor dit protocol worden vermeden.
Besmetting is altijd een punt van zorg bij het werken met parasieten. E. aedis is een succesvolle parasiet van Ae. aegypti en moet daarom gescheiden worden gehouden van niet-geïnfecteerde laboratoriumkolonies om besmetting te voorkomen. We raden aan om besmette muggen indien mogelijk op te slaan in een aparte incubator. We raden ook aan dat materialen die worden gebruikt voor microsporidiawerk (bijvoorbeeld larvetrays, transferpipets, kooien, eierverzamelbekers) worden aangewezen voor microsporidia-werk en niet breder worden gebruikt in het insectarium. Alle opfokmaterialen moeten worden gesteriliseerd met 10% bleekmiddel na gebruik en autoclaving kan worden gebruikt om bleekwatersterilisatie aan te vullen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Spencer Blankenship bedanken voor hulp bij het grootbrengen van muggen. We danken ook James N. Radl en M. Dominique Magistrado voor nuttige feedback op het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mL Specimen cup | McKesson | 911759 | Inexpensive alternative to beaker |
| 150 mL beakers | VWR | 10754-950 | For larval dosing |
| 2 oz round glass bottle | VWR | 10862-502 | Bottle for 10% sucrose in adult cages |
| 3 oz. emergence cup | Henry-Schein | 1201502 | For transfer of pupae to cage |
| Adult mosquito cages | Bioquip | 1462 or 1450ASV | For adult housing |
| Autoclave | For sterilization | ||
| Bleach | For sterilization | ||
| Brewer’s yeast | Solgar | For feeding larvae during dosing | |
| Controlled rearing chamber | Tritech | DT2-MP-47L | Inexpensive small rearing chamber |
| Cotton roll | VWR | 470161-446 | Wick for sugar bottles |
| Defibrinated rabbit blood | Fisher | 50863762 | For blood feeding adults |
| Disodium ATP, crystalline | Sigma-Aldrich | A26209-5G | For blood feeding adults |
| Dry cat food | 9Lives | Indoor Complete | For general larval rearing |
| Fish food flakes | TetraMin | For general larval rearing | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | For counting spores |
| Homogenizer/mixer motor | VWR | 47747-370 | For homogenizing infected larvae |
| Larval rearing trays | Sterillite | 1961 | Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4" |
| Liver powder | NOW foods | 2450 | For feeding larvae during dosing |
| Pipette 1 - 10µL | VWR | 89079-962 | For larval dosing |
| Pipette 100 - 1000µL | VWR | 89079-974 | For food during larval dosing |
| Pipette tips 1 - 10µL | VWR | 10017-042 | For larval dosing |
| Pipette tips 100 - 1000µL | VWR | 10017-048 | For food during larval dosing |
| Plastic pestles | VWR | 89093-446 | For homogenizing infected larvae |
| Sucrose, crystalline | Life Technologies | 15503022 | For adult feeding |
| Transfer pipet | VWR | 414004-033 | For larval transfer, must trim ends |
References
- WHO. Yellow fever. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever (2019).
- WHO. Dengue and severe dengue. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
- Weaver, S. C. Prediction and prevention of urban arbovirus epidemics : A challenge for the global virology community. Antiviral Research. 156, 80-84 (2018).
- Rather, I. A., Parray, H. A., Lone, J. B., Paek, W. K., Lim, J., Bajpai, V. K., Park, Y. H. Prevention and Control Strategies to Counter Dengue Virus Infection. Frontiers In Cellular and Infection Microbiology. 7, 336 (2017).
- Becnel, J. J. Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblysporidae) as a biocontrol agent of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Proceedings and abstracts, Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. , Adelaide, Australia. 20-24 (1990).
- Becnel, J. J., Johnson, M. A. Impact of Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae) on a seminatural population of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Biological Control. 18 (1), 39-48 (2000).
- Becnel, J. J., Sprague, V., Fukuda, T., Hazard, E. I. Development of Edhazardia aedis (Kudo, 1930) N. G., N. Comb. (Microsporida: Amblyosporidae) in the mosquito Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Journal of Protozoology. 36, 119-130 (1989).
- Hembree, S. C., Ryan, J. R. Observations on the vertical transmission of a new microsporidian pathogen of Aedes aegypti from Thailand. Mosquito News. 42, 49-54 (1982).
- Johnson, M. A., Becnel, J. J., Undeen, A. H. A new sporulation sequence in Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae), a parasite of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 70 (1), 69-75 (1997).
- Becnel, J. J., Garcia, J. J., Johnson, M. A. Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae) effects on the reproductive capacity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 32 (4), 549-553 (1995).
- Becnel, J. J., Johnson, M. A. Mosquito host range and specificity of Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 9 (3), 269-274 (1993).
- Andreadis, T. G. Host range tests with Edhazardia aedis (Microsporida: Culicosporidae) against northern Nearctic mosquitoes. Journal of Invertebrate Pathology. 64 (1), 46-51 (1994).
- Becnel, J. J. Safety of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) for nontarget aquatic organisms. Journal of the American Mosquito Control Association. 8 (3), 256-260 (1992).
- Undeen, A. H., Becnel, J. J. Longevity and germination of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) spores. Biocontrol Science and Technology. 2, 247-256 (1992).
- Massaro, P., Sobecki, R., Behling, C., Criswell, V., Zha, T., Devenzengo, R. T. Automated mass rearing system for insect larvae. , Pub. No. US 2018/0092339 A1. USA (2018).
- Methods in Aedes Research. BEI Resources. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf (2016).
- Methods in Anopheles Research. BEI Resources. , Available from: https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf (2014).
- Desjardins, C. A., et al. Contrasting host-pathogen interactions and genome evolution in two generalist and specialist microsporidian pathogens of mosquitoes. Nature Communications. 6 (1), 1-12 (2015).
- Hembree, S. C. Preliminary Report of some mosquito pathogens from Thailand. Mosquito News. 39 (3), 575-582 (1979).
- Solter, L. F., Becnel, J. J., Vávra, J. Research methods for entomopathogenic microsporidia and other protists. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Elsevier Ltd. 329-371 (2012).
- Becnel, J. J., Undeen, A. H. Influence of temperature on developmental parameters of the parasite/host System Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblyosporidae) and Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 60, 299-303 (1992).
