Summary
माइक्रोस्पोरिडियन परजीवी एडहजारडिया एडीआईएस कोसंस्कृति देने के लिए एक प्रोटोकॉल। परजीवी एडीज एजिप्टी मच्छरों की एक पीढ़ी से लार्वा चरण में क्षैतिज हस्तांतरण के माध्यम से अगले तक ले जाया जाता है जिसके बाद वयस्क चरण में ऊर्ध्वाधर संचरण होता है। संक्रमित अंडों में लाइव स्पोरोप्लास्म लंबे समय तक जीवित रहते हैं।
Abstract
एडहजारिया एडीआईएस एडीज एजिप्टी मच्छरों का एक माइक्रोस्पोरिडियन परजीवी है, जो एक रोग वेक्टर है जो कई आर्बोवायरस को प्रसारित करता है जो हर साल लाखों रोग के मामलों का कारण बनता है। ई. एडीआईएस मच्छर वेक्टर में मृत्यु दर और कम प्रजनन फिटनेस का कारण बनता है और बायोकंट्रोल एजेंट के रूप में इसकी क्षमता के लिए पता लगाया गया है। ई. एडीआईएस को बनाने के लिए हम जो प्रोटोकॉल पेश करते हैं, वह इसके प्राकृतिक संक्रमण चक्र पर आधारित है, जिसमें मच्छर मेजबान के विभिन्न जीवन चरणों में क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर संचरण दोनों शामिल हैं। एई. एजिप्टी मच्छर लार्वा चरण में बीजाणुओं के संपर्क में आते हैं। ये संक्रमित लार्वा तो वयस्कों में परिपक्व होते हैं और परजीवी को अपनी संतानों को खड़ी रूप से संचारित करते हैं। संक्रमित संतानों को भविष्य के क्षैतिज संचरण के लिए बीजाणुओं के स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है। संस्कृति ई. एडीआईएस परजीवी के जीवन चक्र की जटिलताओं को देखते हुए अदीक्षित के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और यह प्रोटोकॉल स्पष्टीकरण के लिए विस्तृत मार्गदर्शन और दृश्य एड्स प्रदान करता है।
Introduction
एडीज एजिप्टी कई आर्बोवायरस (जैसे, डेंगू, ज़िका, येलो फीवर) का मच्छर वेक्टर है जो हर साल सैकड़ों लाखों रोग के मामलों के लिए खाते का अनुमान है और 30,000 से अधिक मौतें1,2। इन रोगजनकों के कारण होने वाली बीमारियों का उपचार सहायक देखभाल तक सीमित है और यह संभावना है कि भविष्य में अतिरिक्त आर्बोवायरस उभरकरसामनेआएंगे । मच्छर वेक्टर का नियंत्रण प्राथमिक महत्व का है, क्योंकि यह प्रभावी रूप से वर्तमान और उभरते रोगजनकों के संचरण को रोकता है4। परंपरागत रूप से, वेक्टर नियंत्रण रणनीतियां मुख्य रूप से रासायनिक कीटनाशकों का उपयोग करती हैं, लेकिन कई आमतौर पर उपयोग की जाने वाली कीटनाशकों के प्रतिरोध ने वेक्टर नियंत्रण के उपन्यास तरीकों की मांग को प्रेरित किया है। एई. एजिप्टी के खिलाफ अपने जैव नियंत्रण गुणों के लिए खोजे गए एक संभावित एजेंट परजीवी एडहजारडिया एडीआईएस5,6है।
ई. एडीआईएस,जो पहली बार 1 9 30 में कूडो द्वारा नोसेमा एडीआईएस के रूप में पहचाना जाता है, एई. एजिप्टी मच्छरों का एक माइक्रोस्पोरिडियन परजीवीहै। ईई एडीज का विकास और प्रजनन अपेक्षाकृत जटिल है और इसका जीवन चक्र कई तरीकों से आगे बढ़ सकता है7,8,9. एक सामान्य विकास चक्र का वर्णन बेकनेल एट अल, 19897 में गहराई से किया गया है और इसका उपयोग प्रयोगशाला प्रचार(चित्र 1) 8के लिए कियाजाताहै। संक्षेप में, चक्र तब शुरू होता है जब एई. एजिप्टी अंडे खड़ी ई. एडीआईएस से संक्रमित लार्वा में निकलते हैं जो वसा शरीर में यूनिन्यूलेट बीजाणु विकसित करते हैं, और आमतौर पर लार्वा या प्यूप के रूप में मर जाते हैं। मृत लार्वा से छोड़े गए यूनिन्यूलेट बीजाणु आवास को दूषित करते हैं और स्वस्थ एई. एजिप्टी लार्वा द्वारा निगला जाता है। ये बीजाणु मुख्य रूप से पाचन तंत्र में अंकुरित होते हैं, जो उजागर लार्वा के पाचन ऊतक को संक्रमित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप क्षैतिज संचरण होता है। क्षैतिज रूप से संक्रमित लार्वा वयस्कों (माता-पिता की पीढ़ी) में विकसित होते हैं जहां द्वि नाभिक बीजाणु बनते हैं। मादा में, ये द्विन्यूक्लिट बीजाणु प्रजनन पथ पर आक्रमण करते हैं और उनके संबंधित स्पोरोप्लाज्म अंडे की कोशिकाओं को विकसित करने को संक्रमित करते हैं। ये अंडे तब संक्रमित लार्वा (फिलियल पीढ़ी) में निकलते हैं, जिसके परिणामस्वरूप परजीवी का ऊर्ध्वाधर संचरण और ऊपर वर्णित चक्र की निरंतरता होती है।
कई अध्ययनों ने बायोकंट्रोल के लिए ई एडिस की क्षमता की जांच की है। ई. एडीआईएस के साथ संक्रमण का प्रदर्शन किया गया है जिसके परिणामस्वरूप एई. एजिप्टी महिलाओंकी प्रजनन क्षमता कम हो गई है । इसके अलावा, एक अर्ध-क्षेत्र प्रयोग में, ई. एडीआईएस की जलसंखात्मक रिहाई के परिणामस्वरूप एक परीक्षणएई का कुल उन्मूलन हुआ। मच्छरों की प्रजातियों के विविध सेट में विकास के कुछ चरणों से गुजरने में सक्षम होने के दौरान, ई. एडीज केवल एई. एजिप्टीमें ऊर्ध्वाधर रूप से फैलता है, जो उच्च स्तर की मेजबान विशिष्टता11,12का संकेत देता है। इसी तरह, ई. एडीआईएससे जुड़े संभावित पर्यावरणीय जोखिम के प्रयोगशाला आकलन में, माइक्रोस्पोरिडियन परजीवी गैर-लक्षित जलीय जीवों को संक्रमित करने में विफल रहा, जिसमें शिकारियों ने ई. एडीआईएस13से संक्रमित एई. एजिप्टी लार्वा को निगला। ये परिणाम प्राकृतिक एई. एजिप्टी आबादी को लक्षित करने वाली जैविक नियंत्रण रणनीतियों में उपयोग किए जाने वाले ई. एडीआईएस की क्षमता को उजागर करते हैं।
इस तथ्य के बावजूद कि ई. एडीआईएस वेक्टर नियंत्रण में उपयोग के लिए वादा दिखाता है, इसे व्यापक पैमाने पर बनाने और तैनात करने के लिए चुनौतियां हैं। ई. एडीस बीजाणु ठंडे तापमान (यानी, 5 डिग्री सेल्सियस) पर एक दिन से भी कम समय में संक्रमितता खो देते हैं। यहां तक कि गर्म तापमान (यानी, 25 डिग्री सेल्सियस) पर, बीजाणु तेजी से तीन सप्ताह14के दौरान संक्रमितता खो देते हैं । इसके अतिरिक्त, ई. एडीज को लाइव एई में सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। एजिप्टी मच्छरों और स्वस्थ लार्वा मच्छरों की नियंत्रित डोजिंग जीवन चक्र को पूरा करने और संस्कृति 8 के लिए उपयोग की जाने वालीआबादीके पतन को रोकने के लिए आवश्यक है। वीवो संस्कृति में की आवश्यकता एक चुनौती प्रस्तुत करता है; हालांकि, मच्छर मास पालन और रोबोटिक्स (जैसे, मासारो एट अल15)में हाल की प्रगति ई. एडीस बीजाणुओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए अनुमति दे सकती है। हम आशा करते हैं कि इस पद्धति के दृश्य से ई. एडीआईएस पालन प्रोटोकॉल तक पहुंच बढ़ेगी और अधिक शोधकर्ताओं को इस प्रणाली की बुनियादी जीव विज्ञान और लागू क्षमता की जांच करने की अनुमति मिलेगी। हम यह भी आशा करते हैं कि यह इंजीनियरों, रोबोटिक्स और व्यापक प्रौद्योगिकी क्षेत्र के साथ सहयोग बढ़ाने की सुविधा प्रदान करेगा, जो ई. एडीआईएसके बड़े पैमाने पर पालन में सुधार करने का काम कर सकता है ।
चित्रा 1: ई. एडीज प्रचार एई. एजिप्टीमें । ई. एडीआईएस का प्रचार ई एडिस संक्रमित अंडों से हैचिंग के साथ शुरू होता है। संक्रमित लार्वा को 4 वें इंस्टार मेंपाला जाता है, ई. एडीस बीजाणु उन लार्वा सेअलग होते हैं, और बीजाणुओं का उपयोग अंडे के असंक्रमित क्लच (क्षैतिज संचरण) से पाला जाता है। इन मौखिक रूप से संक्रमित लार्वा को तब वयस्कता (माता-पिता की पीढ़ी) में पाला जाता है और ई. एडीआईएस (ऊर्ध्वाधर संचरण) से संक्रमित अंडे डालते हैं। संक्रमित अंडे (संतानीय पीढ़ी) तो संक्रमण चक्र और परजीवी संस्कृति जारी रखने के लिए रची जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Protocol
1. दिन 0
- हैच ए. एजिप्टी अंडे ई एडीआईएस से संक्रमित 1 एल डियोनाइज्ड (डीआई) पानी के साथ लार्वा पालन ट्रे में रखकर। इसमें 50 मिलीग्राम फिश फूड डालें।
नोट: प्रकाशन के समय, ई. एडीआईएस की एक प्रयोगशाला तनाव केवल परजीवी पर सक्रिय रूप से शोध करने वाली प्रयोगशालाओं से उपलब्ध है, क्योंकि ई. एडीआईएस दीर्घकालिक भंडारण के लिए उत्तरदायी नहीं है और संक्रमित अंडे वर्तमान में भंडार में संग्रहीत नहीं हैं। ई. एडीआईएस के साथ काम करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ता संक्रमित अंडों का अनुरोध करने के लिए इसी लेखक से संपर्क कर सकते हैं।
नोट: संक्रमित अंडों की बड़ी संख्या हैचिंग आम तौर पर आवश्यक नहीं है; दस ई. एडीस संक्रमित एई. एजिप्टी लार्वा 1000 स्वस्थ लार्वा ≥ खुराक के लिए पर्याप्त हैं।
नोट: इस प्रोटोकॉल के सभी भागों के लिए, हमने निम्नलिखित स्थितियों में मच्छरों को रखा: 14 एच/10 एच प्रकाश/डार्क चक्र, 27 डिग्री सेल्सियस तापमान और ८०% सापेक्ष आर्द्रता ।
2. दिन 1
- हैचिंग के बाद, लार्वा के घनत्व को प्रति ट्रे ~ 100 लार्वा तक कम करें, नई ट्रे को आवश्यक के रूप में (1 एल डीआई पानी के साथ भी) बना दिया।
- प्रत्येक ट्रे में सूखी बिल्ली के भोजन का एक टुकड़ा जोड़ें। समाप्त होने पर भोजन की भरपाई करें, लेकिन भोजन की अधिकता प्रदान न करें। बिल्ली के भोजन का एक टुकड़ा (~ 200 मिलीग्राम) हर तीन दिन पर्याप्त है।
नोट: विशिष्ट पालन स्थितियों के आधार पर भोजन की मात्रा को समायोजित करें (यानी, भोजन को कम करें यदि पानी टर्बिड हो जाता है या लार्वा मर रहे हैं, तो लार्वा के विकास में गंभीर रूप से देरी होने पर भोजन बढ़ाएं)। यहां सुझाए गए लोगों की तुलना में अन्य फीडिंग रेजिस्टेंस और/या पालन शर्तों का इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन इस मानक प्रोटोकॉल के समय में समायोजन की जरूरत हो सकती है ।
3. दिन 4 \ u20125
- जब संक्रमित लार्वा3- 4th इनस्टार होते हैं, तो एक नई ट्रे में स्वस्थ/असंक्रमित एई. एजिप्टी अंडे है।
- घनत्व पर रियर ऐसे है कि स्वस्थ एई. एजिप्टी 48-72 घंटेमें 2-3 स्टार तक पहुंचता है । हमारे हाथों में, यह भोजन के लिए विज्ञापन libitum का उपयोग के साथ पानी के 1 एल प्रति 200 \ u2012300 लार्वा के घनत्व का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । कई दिनों में स्वस्थ अंडों के बैचों को हैचिंग करने से यह गारंटी मिल सकती है कि जरूरत पड़ने पर लार्वा सही अवस्था में होते हैं।
4. दिन 7 \ u20128: क्षैतिज संचरण
नोट: ई. एडीआईएस के साथ स्वस्थ लार्वा की डोजिंग तब तक नहीं की जा सकती जब तक कि संक्रमित लार्वा (1 x 104 - 106 प्रति लार्वा) में यूनिन्यूलेट बीजाणु उच्च संख्या में न हों। यह 4 इंस्टार स्टेज(चित्रा 2)में देरसे होता है ।
- फसल और यूनिन्यूलेट बीजाणुओं की मात्रा।
- 10 संक्रमित लार्वा को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में ले जाने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट (किसी को टिप को व्यापक व्यास में काटना पड़ सकता है) का उपयोग करें।
- एक हस्तांतरण पिपेट के साथ प्रजनन पानी निकालें और साफ डीआई पानी के ~ 1 एमएल जोड़कर एक बार धोएं। एक पाइप के साथ धोने के पानी को हटा दें, 10 लार्वा में 500 μL साफ डीआई पानी जोड़ें, और मूसल और यांत्रिक समरूप का उपयोग करके समरूपता दें।
- 400x आवर्धन पर एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर बीजाणुओं की मात्रा।
नोट: यूनिन्यूलेट बीजाणुों को उनके अलग पाइरिफॉर्म आकार (यानी नाशपाती के आकार) द्वारा पहचाना जा सकता है; चित्रा 2A)।
- खुराक स्वस्थ एई. ई. एडीआईएस के साथ एजिप्टी लार्वा।
- 1.2 ग्राम लिवर पाउडर, 0.8 ग्राम ब्रेवर के खमीर और 100 एमएल पानी मिलाकर ताजा लार्वा भोजन घोल बनाएं।
नोट: भोजन को ताजा होने की आवश्यकता नहीं है यदि इसे उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्वचालित और संग्रहीत किया जाता है। - 1002 nd - 3इंस्टाल हेल्दी एई. एजिप्टी लार्वा को 150 एमएल बीकर्स या च्ते कप में ट्रांसफर करें।
- 5 x 104 - 1 x 105 बीजाणुओं के साथ 100 लार्वा के प्रत्येक बीकर की खुराक।
- 100 एमएल की अंतिम मात्रा में लार्वा भोजन घोल और डीआई पानी के 2 एमएल जोड़ें।
- 1.2 ग्राम लिवर पाउडर, 0.8 ग्राम ब्रेवर के खमीर और 100 एमएल पानी मिलाकर ताजा लार्वा भोजन घोल बनाएं।
- 12-24 घंटे के एक्सपोजर के बाद, एक मानक पालन प्रोटोकॉल16के बाद ट्रे और पीछे वयस्कता के लिए पालन में उजागर लार्वा हस्तांतरण ।
5. मॉनिटरिंग और वर्टिकल ट्रांसमिशन
- पिल्ला और स्थानांतरण पिल्ले के लिए डोज लार्वा की निगरानी करें क्योंकि वे पिंजरे में उद्भव कप में विकसित होते हैं। चीनी फ़ीड वयस्कों विज्ञापन libitum (16,17के अनुसार) । E. aedisसे वयस्कों को बंद करना संक्रमित होगा ।
- रक्त वयस्कों को खिलाएं(16, 17के अनुसार) और अंडे एकत्र करें। ई. एडीआईएस का ऊर्ध्वाधर संचरण इस कदम पर होता है।
नोट: यदि अंडाशय पूरा होते ही अतिरिक्त रक्त भोजन प्रदान किया जाता है, तो वयस्कों को मृत्यु दर के उच्च स्तर (अक्सर अचानक) पीड़ित होने से पहले महिलाएं अंडे का कम से कम एक अतिरिक्त क्लच रख सकती हैं। - इस प्रोटोकॉल के चरण 1 के साथ शुरू प्रचार जारी रखने के लिए ई. एडीआईएस से संक्रमित इन एई. एजिप्टी अंडे का उपयोग करें।
नोट: अंडे को उचित शर्तों के तहत 2 - 3 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है16. - प्रदूषण को रोकने के लिए 10% ब्लीच और ऑटोक्लेविंग (यदि संभव हो तो) के साथ ई. एडीआईएस के संपर्क में आने वाली सभी सामग्रियों को साफ करें।
Representative Results
ई. एडीस संक्रमित एई. एजिप्टी लिवरपूल (एलवीपी1b12)अंडे ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में रची गई थी । 4वें इंस्टार चरण में, संक्रमण के दृश्य लक्षण देखे जा सकते हैं, जिसमें संक्रमित लार्वा के वसा निकायों में सफेद बीजाणु अल्सर शामिल हैं (इस फेनोटाइप का एक उदाहरण चित्रा 2 बीमें दिखाया गया है)। 500 माइक्रोन डीआई पानी में10 लार्वा को समरूप बनाकर 4 इंस्टार लार्वा से यूनिन्यूलेट बीजाणुओं को काटा गया। ये बीजाणु पाइरिफॉर्म (नाशपाती के आकार) थे और 400x(चित्रा 2 ए)पर आसानी से दिखाई देते थे। एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करना, 4.05 x 103 बीजाणुओं/μL की एक बीजाणु गिनती की गणना की गई थी। १०० स्वस्थ एई. एजिप्टी लार्वा तो क्षैतिज ~५०० बीजाणुओं/लार्वा की अंतिम खुराक के लिए १०० मिलीएल पानी में ~५०,००० बीजाणुओं से संक्रमित थे । लार्वा को वयस्कता (माता-पिता की पीढ़ी) में पाला गया था और डिफिब्रिनेड खरगोश रक्त प्लस 1% (v/v) 100 m m adenosine triphosphate का उपयोग करके रक्त खिलाया गया था। खड़ी संक्रमित अंडे (संतानीय पीढ़ी) एकत्र किए गए थे और ई. एडीआईएस प्रचार जारी रखने और संक्रमण की सफलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए रची गई थीं।
सात दिनों के बाद हैचिंग, 25 संतानीय पीढ़ी के लार्वा को व्यक्तिगत १.५ एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित किया गया और एक बार डीआई पानी के साथ धोया गया । डीआई पानी और संक्रमण की स्थिति के 250 माइक्रोन में व्यक्तिगत लार्वा को समरूप बनाया गया था और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके ई. एडीस लोड का आकलन किया गया था। फिलियल जेनरेशन में ई. एडीआईएस की वर्टिकल इंफेक्शन रेट 96% पाई गई और सात दिन बाद संक्रमित व्यक्तियों का मतलब बीजाणु लोड 3.31 x 105 (रेंज: 3.25 x 104 - 1.47 x 106; चित्रा 3)।
चित्र 2: एई. एजिप्टी मच्छरों में ई. एडीज संक्रमण का दृश्य। (A) ई. एडीज यूनिन्यूलेट पाइरिफॉर्म बीजाणु। दस ई. एडीआईएस संक्रमित4 इंस्टार लार्वा को डीआई पानी के 500 माइक्रोन में लगभग सात दिन बाद हैचिंग किया गया था। समरूप के 10 माइक्रोन को हीमोसाइटोमीटर पर लोड किया गया था और 400X पर देखा गया था। लाल तीर प्रतिनिधि यूनिन्यूलेट ई. एडीआईएस बीजाणुओं को इंगित करते हैं। (ख) ई एडीस संक्रमित 4 इंस्टार लार्वा अपने पूरे वसा शरीर में विशिष्ट सफेद बीजाणु अल्सर विकसित करते हैं18. वे भी आमतौर पर विकृत और पेट खंडों distended है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: संस्कृति प्रोटोकॉल फिलियल पीढ़ी में प्रभावी ई. एडीआईएस संक्रमण की ओर जाता है। ऐ. एगिप्टी लार्वा (एन = 25) फिलियल पीढ़ी से 250 माइक्रोन डीआई पानी में व्यक्तिगत रूप से समरूप थे और समरूप के 10 माइक्रोन को हीमोसाइटोमीटर पर लोड किया गया था। यूनिन्यूलेट बीजाणुओं की उपस्थिति ने एक सकारात्मक संक्रमण का संकेत दिया और सभी सकारात्मक नमूनों के लिए बीजाणुओं की मात्रा निर्धारित की गई। (क)फिलियल लार्वा के बीच संक्रमण की व्यापकता। ग्रे असंक्रमित लार्वा से मेल खाता है, और संक्रमित करने के लिए काला। प्रत्येक सेगमेंट पर प्रदर्शित नंबर प्रत्येक समूह में व्यक्तियों की पूर्ण गिनती देते हैं। (ख)प्रत्येक संक्रमित व्यक्ति के लिए बीजाणु भार। काले डॉट्स प्रत्येक लार्वा के लिए लॉग10 परिवर्तित यूनिन्यूलेट बीजाणु गिनती का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
हम यहां मूल रूप से हेम्ब्री और रयान, १९८२८ में ई. एडीज माइक्रोस्पोराइडिया को पालने के लिए वर्णित विधि पेश करते हैं। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले ई एडिस का तनाव 197919में थाईलैंड में स्टीफन हेम्ब्रे द्वारा मूल क्षेत्र संग्रह से लिया गया था। यह विधि क्षैतिज संचरण पर कैपिटल होती है, जो स्वाभाविक रूप से ई. एडीआईएस7 के संचरण चक्र में होतीहै, परजीवी कोनियंत्रिततरीके से प्रचारित करने के लिए। यह विधि उन नए चेहरे के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती है जो बीजाणु उपस्थिति, लार्वा में संक्रमण के लक्षणों, या बहु-चरण पालन/डोजिंग प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक पूरा करने के लिए आवश्यक समन्वय से परिचित नहीं हैं। हमारी आशा है कि दृश्य एड्स है कि इस प्रोटोकॉल के साथ शोधकर्ताओं जो संस्कृति ई. aedis की इच्छा के लिए प्रवेश करने के लिए बाधाओं को कम करेगा ।
हमने एई. एजिप्टी में ई. एडीजिप्टी को ऊपर वर्णित किया है और फिलियल पीढ़ी में परजीवीवाद की सफलता की मात्रा निर्धारित की है। संक्षेप में, हमने ई. एडीस संक्रमित एई. एजिप्टी अंडे को रचा, उन्हें 4वें इंस्टार में पाला, और संक्रमित लार्वा से यूनिन्यूलेट ई. एडीआईएस बीजाणु एकत्र किए। हम तो क्षैतिज मौखिक घूस के माध्यम से इन बीजाणुओं के साथ स्वस्थ लार्वा संक्रमित है, और वयस्कता के लिए क्षैतिज संक्रमित लार्वा पाला । हमने संक्रमित वयस्कों (माता-पिता की पीढ़ी) और एकत्र अंडे (संतानीय पीढ़ी) को रक्त खिलाया, जिसे हमने परिकल्पना की थी कि ई. एडीस परजीवी से ऊर्ध्वाधर रूप से संक्रमित होगा। हमने फिलियल पीढ़ी से अंडे लिए और लार्वा के एक सबसेट को एकत्र और समरूप किया जब वे 4वें स्टार थे। हमने ई. एडीआईएस से संक्रमित लार्वा के प्रतिशत और सभी संक्रमित व्यक्तियों में कुल बीजाणु गिनती की मात्रा निर्धारित की। हमने पाया कि विशाल बहुमत (96%) व्यक्तियों के संक्रमित थे और संक्रमित लार्वा का मतलब बीजाणु लोड ~ 105था . हम निष्कर्ष निकालते हैं कि हमारे पालन प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप एई. एजिप्टी मच्छरों में ई. एडीज का अत्यधिक सफल प्रचार हुआ ।
इस प्रोटोकॉल के कई पहलू हैं जो अदीक्षित उपयोगकर्ता के लिए विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। हम कुछ अतिरिक्त जानकारी है कि सहायता की हो सकती है नीचे की पेशकश करते हैं । सामान्य मच्छर पालन के बारे में सवालों के लिए, एई. एजिप्टी कॉलोनी रखरखाव के लिए एक पूर्ण गाइड इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है। हालांकि, कई सामान्य सवालों को बायोडिफेंस और उभरते संक्रमण अनुसंधान संसाधन भंडार16,17 से संसाधनों द्वारा संबोधित किया जा सकता है जिसमें अंडा हैचिंग, सामान्य आहार की जरूरत, आवास और पर्यावरणीय स्थितियां, और रक्त आहार शामिल हैं। संक्रमण की समयरेखा के बारे में, संक्रमित अंडों से रची गई लार्वा 4th इंस्टार चरण में देर तक संक्रमण के लक्षण नहीं दिखाती है। 1-2 दिनों के दौरान, यूनिन्यूलेट बीजाणु तेजी से दिखाई देते हैं। लार्वा 6 दिनों के बाद से हैचिंग पर लगभग असंक्रमित दिखाई दे सकता है लेकिन 7 या 8 के बाद के दिन से अत्यधिक संक्रमित हो सकता है। इसके अतिरिक्त, समरूप नमूनों में बीजाणुओं की कल्पना करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि पूरे मच्छर समरूप में कई अन्य रोगाणु मौजूद हैं, जिनमें ई. एडीआईएस यूनिन्यूलेट बीजाणुओं के समान आकार के अन्य यूकेरियोटिक एकल-कोशिकीय जीव (जैसे, खमीर) शामिल हैं। ई. एडीआईएस बीजाणु(चित्रा 2 ए)का विशिष्ट आकार पहचान के लिए एक अत्यधिक विश्वसनीय तरीका है और समरूप में अन्य रोगाणुओं से ई. एडीआईएस को अलग करने में मदद करेगा। हालांकि यह पहचान या मात्राकरण के लिए आवश्यक नहीं है, यदि बीजाणु शुद्धिकरण वांछित है, तो इसे कोलॉयडल सिलिका घनत्व ग्रेडिएंट अपकेंद्रित्र के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है जो समरूप में अन्य दूषित तत्वों से ई एडिस बीजाणुओं को अलग करने की अनुमति देगा। इस प्रक्रिया को सोल्टर एट अल20में विस्तार से वर्णित किया गया है।
पालन प्रथाओं में उपयोग किए जाने वाले तापमान और आहार आमतौर पर प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न होते हैं, लेकिन विविधताओं से अभी भी सफल परजीवी प्रचार की संभावना होगी। लार्वा खाद्य प्रकार में मामूली अंतर सफल संक्रमण में हस्तक्षेप नहीं करते हैं, हालांकि हमने इस प्रोटोकॉल में विभिन्न खाद्य प्रकारों का स्पष्ट रूप से परीक्षण नहीं किया। संक्रमण पर तापमान के प्रभाव का परीक्षण किया गया है और ई. एडीस संक्रमण21के तापमान की एक विस्तृत श्रृंखला पर मजबूत पाया गया था । अधिकतम बीजाणु उत्पादन 30.8 डिग्री सेल्सियस पर हुआ, लेकिन अभी भी 20 डिग्री सेल्सियस के रूप में कम तापमान पालन में मजबूत था । बीजाणु गिनती नाटकीय रूप से उच्च पालन तापमान (36 डिग्री सेल्सियस) पर कम हो गई थी, इसलिए इस प्रोटोकॉल के लिए इन तापमान से बचा जाना चाहिए।
परजीवी के साथ काम करते समय प्रदूषण हमेशा एक चिंता का विषय होता है। ई. एडीआईएस एई. एजिप्टी का एक सफल परजीवी है और इसलिए संदूषण को रोकने के लिए असंक्रमित प्रयोगशाला उपनिवेशों से अलग रखा जाना चाहिए। हम यदि संभव हो तो संक्रमित मच्छरों को एक अलग इनक्यूबेटर में भंडारण की सलाह देते हैं। हमने यह भी सिफारिश की है कि माइक्रोस्पोराइडिया कार्य (जैसे, लार्वा ट्रे, स्थानांतरण पिपेट, पिंजरे, अंडा संग्रह कप) के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री माइक्रोस्पोराइडिया काम के लिए नामित की जाती है और पूरे कीटनाशक में अधिक मोटे तौर पर उपयोग नहीं की जाती है। उपयोग के बाद 10% ब्लीच के साथ सभी पालन सामग्रियों को निष्फल किया जाना चाहिए और ब्लीच नसबंदी के पूरक के लिए ऑटोक्लेविंग का उपयोग किया जा सकता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम मच्छर पालने के साथ मदद के लिए स्पेंसर ब्लैंकशिप का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम पांडुलिपि पर उपयोगी प्रतिक्रिया के लिए जेम्स एन राडल और एम डोमिनिक मैजिस्ट्राडो को भी धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mL Specimen cup | McKesson | 911759 | Inexpensive alternative to beaker |
| 150 mL beakers | VWR | 10754-950 | For larval dosing |
| 2 oz round glass bottle | VWR | 10862-502 | Bottle for 10% sucrose in adult cages |
| 3 oz. emergence cup | Henry-Schein | 1201502 | For transfer of pupae to cage |
| Adult mosquito cages | Bioquip | 1462 or 1450ASV | For adult housing |
| Autoclave | For sterilization | ||
| Bleach | For sterilization | ||
| Brewer’s yeast | Solgar | For feeding larvae during dosing | |
| Controlled rearing chamber | Tritech | DT2-MP-47L | Inexpensive small rearing chamber |
| Cotton roll | VWR | 470161-446 | Wick for sugar bottles |
| Defibrinated rabbit blood | Fisher | 50863762 | For blood feeding adults |
| Disodium ATP, crystalline | Sigma-Aldrich | A26209-5G | For blood feeding adults |
| Dry cat food | 9Lives | Indoor Complete | For general larval rearing |
| Fish food flakes | TetraMin | For general larval rearing | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | For counting spores |
| Homogenizer/mixer motor | VWR | 47747-370 | For homogenizing infected larvae |
| Larval rearing trays | Sterillite | 1961 | Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4" |
| Liver powder | NOW foods | 2450 | For feeding larvae during dosing |
| Pipette 1 - 10µL | VWR | 89079-962 | For larval dosing |
| Pipette 100 - 1000µL | VWR | 89079-974 | For food during larval dosing |
| Pipette tips 1 - 10µL | VWR | 10017-042 | For larval dosing |
| Pipette tips 100 - 1000µL | VWR | 10017-048 | For food during larval dosing |
| Plastic pestles | VWR | 89093-446 | For homogenizing infected larvae |
| Sucrose, crystalline | Life Technologies | 15503022 | For adult feeding |
| Transfer pipet | VWR | 414004-033 | For larval transfer, must trim ends |
References
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