Analys och specifikation av storleksfördelningar för stärkelsegranulat

Summary

Presenteras här är ett förfarande för reproducerbara och statistiskt giltiga bestämningar av stärkelse granulat storlek fördelningar, och för att specificera de bestämda granulat lognormal storlek fördelningar med hjälp av en två-parameter multiplikativ form. Det är tillämpligt på alla granulat storleksanalyser av gram-skala stärkelseprover för växt- och livsmedelsvetenskaplig forskning.

Abstract

Stärkelse från alla växtkällor består av granulat i en rad olika storlekar och former med olika förekomstfrekvenser,dvs. Stärkelsegranulatstorleksdata som bestäms med hjälp av flera typer av partikelstorlekstekniker är ofta problematiska på grund av dålig reproducerbarhet eller brist på statistisk signifikans till följd av vissa oöverstigliga systematiska fel, inklusive känslighet för granulatformer och gränser för granulatprovstorlekar. Vi skisserade ett förfarande för reproducerbara och statistiskt giltiga bestämningar av stärkelse granulat storlek distributioner med hjälp av elektrisk avkänning zon teknik, och för att specificera de bestämda granulat lognormal storlek fördelningar med hjälp av en antagen två-parameter multiplikativ form med förbättrad noggrannhet och jämförbarhet. Det är tillämpligt på alla granulatstorleksanalyser av gramskalsstärkelseprover och kan därför underlätta studier av hur stärkelsegranulatstorlekar formas av stärkelsebiosyntesapparaten och mekanismerna. och hur de påverkar egenskaper och funktionalitet hos stärkelse för mat och industriell användning. Representativa resultat presenteras från replikatanalyser av granulat storlek distributioner av sweetpotato stärkelse prover med hjälp av det skisserade förfarandet. Vi diskuterade vidare flera viktiga tekniska aspekter av förfarandet, särskilt multiplikativ specifikation av granulat lognormal storlek distributioner och vissa tekniska medel för att övervinna täta bländare blockering av granulat aggregat.

Introduction

Stärkelsegranulat är den fysiska struktur där två huvudreservhomoglukanpolymerer i växtfotosyntes och lagringsvävnader, den linjära eller glest förgrenade amylosen och det mycket förgrenade amylopectinet, packas ordnat tillsammans med några mindre komponenter, inklusive lipider och proteiner. Stärkelsegranulat från olika växtarter uppvisar många tredimensionella (3D) former (granskade i ref.^1,2), inklusive sfärer, ellipsoider, polyhedroner, trombocyter, kuber, kuber och oregelbundna tubuler. Även de från samma vävnad eller olika vävnader av samma växtart kan ha en uppsättning former med varierande förekomstfrekvenser. Med andra ord kan stärkelsegranulat från en växtart ha en karakteristisk statistisk formfördelning snarare än en specifik form. De icke-enhetliga och icke-sfäriska granulatformerna gör det svårt att korrekt mäta och definiera stärkelsegranulatstorlekar. Dessutom är stärkelsegranulat från samma vävnader av en växtart av en rad storlekar med olika proportioner, dvs. Denna storleksfördelning komplicerar ytterligare analysen och beskrivningen av stärkelsegranulatstorlekar.

Stärkelsegranulatstorlekar har analyserats med hjälp av flera kategorier av partikelstorlekstekniker (granskade i ref.³), inklusive mikroskopi, sedimentering/sterisk fältflödesfraktion (Sd/StFFF), laserdiffraktion och elektrisk avkänningszon (ESZ). Dessa tekniker är dock inte lika lämpade för bestämning av stärkelsegranulatstorlekar i närvaro av en granulatform och en storleksfördelning. Mikroskopi, inklusive ljus, konfokal och scanning elektronmikroskopi, är utmärkt för studier av morfologi^4,5,6,7,struktur^8,9 och utveckling^10,11 av stärkelsegranulat, men knappast lämpad för att definiera deras storleksfördelningar på grund av några inneboende brister. Direkta mätningar av mikroskopiska granulatbilder eller programvaruassisterad bildanalys av optiska mikroskopidata (IAOM), som har använts för bestämning av granulatstorlekar av stärkelse från flera arter. inklusive majs¹²,^{vete 13,14},^{potatis 15} och korn¹⁶, kan mäta endast 1D (vanligtvis maximal längd) eller 2D (yta) storlekar av mycket begränsat antal (tiotusentals till några tusen) stärkelse granulat bilder. De små granulatprovtagningsstorlekarna som i sig begränsas av teknikerna kan sällan vara statistiskt representativa, med tanke på de enorma granulattalen per enhetsvikt av stärkelse (~ 120 x 10⁶ per gram, förutsatt att alla 10 μm sfärer vid 1,5 g / cm³ densitet), och därför kan leda till den dåliga reproducerbarheten av resultaten. Sd/StFFF-tekniken kan ha hög hastighet och upplösning, och smala storleksfraktioner av stärkelsegranulat¹⁷, men har sällan använts förmodligen för att dess noggrannhet kan påverkas allvarligt av skador, olika former och densitet av stärkelsegranulat. Laserdiffraktionstekniken är den mest använda, och har tillämpats för stärkelsegranulatstorleksanalyser för alla större växtarter^3,14,16. Även om tekniken har många fördelar, är den faktiskt inte lämplig för bestämningar av stärkelsegranulatstorlekar i närvaro av en granulatformfördelning. De flesta av de samtidiga laserdiffraktionsinstrumenten förlitar sig på Mie ljusspridningsteori¹⁸ för enhetliga sfäriska partiklar och den modifierade Mie-teorin¹⁸ för några andra former av enhetlighet. Tekniken är därför i sig mycket känslig för partikelformer, och inte helt lämpad även för vissa former av enhetlighet¹⁹, än mindre för stärkelsegranulat med en uppsättning former av varierande proportioner. ESZ-tekniken mäter den elektriska fältstörningen proportionell mot volymen av partikeln som passerar genom en bländare. Den ger granulatvolymstorlekar, liksom nummer- och volymfördelningsinformation etc., med hög upplösning. Eftersom ESZ-tekniken är oberoende av eventuella optiska egenskaper hos partiklar inklusive färg, form, komposition eller brytningsindex, och resultaten är mycket reproducerbara, är den särskilt lämplig för att bestämma storleksfördelningar av stärkelsegranulat med en uppsättning former.

Stärkelsegranulatstorlekar har också definierats med hjälp av många parametrar. De beskrevs ofta förenklat av genomsnittliga diametrar, som i vissa fall var de aritmetiska sätten för de mikroskopiskt uppmätta maximala längderna på 2D-bilder^12,20, eller medelvärden av motsvarande sfärdiametrar³. I andra fall specificerades granulatstorleksfördelningarna med storleksintervallen^21,22, fördelningens medelvolym eller medeldiameter (sfärekvivalenter, viktade efter antal, volym eller yta) förutsatt en normal fördelning^{14,23,24,25,26}. Dessa deskriptorer av stärkelsegranulatstorlekar från olika analyser är av en helt annan natur och inte strikt jämförbara. Det kan vara mycket vilseledande om dessa “storlekar” av stärkelsegranulat från olika arter eller till och med samma vävnader av samma art jämfördes direkt. Dessutom har parametern spread (eller form) för de förmodade normala fördelningar, dvs. standardavvikelsen σ (eller den grafiska standardavvikelsen σ_g)som mäter fördelningens bredd (dvs. storleksspridningen), ignorerats i de flesta studier.

För att lösa de ovannämnda kritiska problem som stärkelse granulat storlek analyser, skisserade vi ett förfarande för reproducerbara och statistiskt giltiga bestämningar av granulat storlek distributioner av stärkelse prover med hjälp av ESZ tekniken, och för korrekt specificera den bestämda granulat lognormal storlek distributioner med hjälp av en antagen två-parameter multiplikativ form²⁷ med förbättrad noggrannhet och jämförbarhet. För validering och demonstration utförde vi replikerade granulatstorleksanalyser av sweetpotato stärkelseprover med hjälp av proceduren, och specificerade lognormala differentialvolym-procent volym-ekvivalenter-sfärdiameterfördelningar med hjälp av deras grafiska geometriska medel och multiplikativa standardavvikelser s* i en ^x/ (multiplicera och dela) s* form.

Protocol

1. Beredning av stärkelseprover Bered två (eller tre) gram-skala replikera stärkelseprover från stärkelseackumulerande vävnader av olika växtarter enligt de fastställdaförfarandena (t.ex. potatis 15, sweetpotatoes28,vetekorn 13,29och majskärnor30,etc.). Tvätta stärkelseprover noggrant med aceton eller toluen 3-4x för att minimera granulataggregat och torka dem…

Representative Results

För att validera proceduren och visa reproducerbarhet av den bestämda granulat storleksfördelningen utförde vi replikat storleksanalyser av sweetpotato stärkelse prover. Vi beredde replikat (S1 och S2) stärkelseprover från fältodlade sweetpotatoes av en avelslinje SC1149-19 vid en liknande utvecklingsålder med hjälp av ett tidigare beskrivetförfarande 28. Från varje stärkelse extrakt, två 0,5 g aliquots (a och b) provtogs, suspenderas i 5 mL metanol och ultraljud med flera pulser av …

Discussion

Det skisserade förfarandet har löst några kritiska problem i flera befintliga metoder för stärkelse granulat storlek analyser, inklusive olämplig 1D eller 2D storlek av 3D granulat, förvrängning av storlek mätningar på grund av att ingen enhetlig granulat former, dålig reproducerbarhet och tvivelaktiga statistiska giltighet på grund av begränsade granulat-prov storlekar, felaktig eller felaktig specifikation (särskilt användningen av den genomsnittliga storleken) av granulat storlekar i närvaro av både g…

Materials

Analytical beaker	Beckman Coulter Life Sciences	A35595	Smart-Technology (ST) beaker
Aperture tube, 100 µm	Beckman Coulter Life Sciences	A36394	For the MS4E, , 1000 µm
Disposable transfer pipettor,	Fisher Scientific (Fishersci.com)	13-711-9AM	Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used.
Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml	Fisher Scientific (Fishersci.com)	05-539-13	Any other similar types of tubes can be used.
Glass beakers, 150 to 250 ml	Fisher Scientific (Fishersci.com)	02-540K	These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirer between runs.
LiCl	Fisher Chemical	L121-100
Methanol	Fisher Chemical	A412-500	Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol.
Mettler Toledo ML-T Precision Balances	Mettler Toledo	30243412	Any other precision balance with a readablity 0.01 g to 1 mg will work.
Multisizer 4e Coulter Counter	Beckman Coulter Life Sciences	B23005	The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company.
Ultrasonic processor UP50H	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H	Other laborator sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension.