잘 제어되고 국소화되지 않은 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans의 칼슘 이미징
1Program of Biomedical Science, Graduate School of Integrated Sciences for Life,Hiroshima University, 2Institute for Quantum Life Science,National Institute for Quantum and Radiological Science and Technology, 3National Institute for Radiological Sciences,National Institute for Quantum and Radiological Science and Technology, 4JST, PRESTO
Summary
여기에 보고된 것은 잘 제어되고 국소화되지 않은 진동을 가진 자유롭게 행동하는 예쁜꼬 마선충에서 칼슘 이미징을 위한 시스템이다. 이 시스템을 통해 연구원은 나노 규모의 변위에서 잘 제어 된 특성을 가진 비 국부적 인 진동을 불러 일으키고 진동에 대한 C. elegans 의 반응 중에 칼슘 전류를 정량화 할 수 있습니다.
Abstract
진동 및 음향파와 같은 비국부적 인 기계적 힘은 개발에서 항상성에 이르기까지 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칩니다. 동물은 행동을 수정함으로써 이러한 자극에 대처합니다. 이러한 행동 수정의 기초가되는 메커니즘을 이해하려면 관심있는 행동 중 신경 활동의 정량화가 필요합니다. 여기에서, 우리는 특정 주파수, 변위 및 지속 시간의 비 국소 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans 에서 칼슘 이미징 방법을보고합니다. 이 방법을 사용하면 음향 변환기를 사용하여 잘 제어되고 국부적이지 않은 진동을 생산하고 단일 세포 분해능에서 유발 된 칼슘 반응을 정량화 할 수 있습니다. 원리의 증거로서, 진동에 대한 C. elegans 의 탈출 반응 동안 단일 인터뉴런 인 AVA의 칼슘 반응이 입증됩니다. 이 시스템은 기계적 자극에 대한 행동 반응의 기초가되는 신경 메커니즘에 대한 이해를 촉진 할 것입니다.
Introduction
동물들은 종종 진동 또는 음향파(1,2)와 같은 비국부적인 기계적 자극에 노출된다. 이러한 자극이 항상성, 발달 및 번식에 영향을 미치 기 때문에 동물은 3,4,5에 대처하기 위해 행동을 수정해야합니다. 그러나 이러한 행동 수정의 기초가되는 신경 회로와 메커니즘은 잘 이해되지 않습니다.
선충류의 Mechanosensory 행동 인 Caenorhabditis elegans는 단순한 행동 패러다임으로, 웜은 일반적으로 비 국소 진동을 만날 때 전진 운동에서 후진 탈출 반응으로 행동을 변경합니다6. 이 행동의 기초가되는 신경 회로는 주로 다섯 개의 감각 뉴런, 네 쌍의 인터뉴런 및 여러 유형의 운동 뉴런 7,8로 구성됩니다. 추가적으로, 웜은 반복적인 자극을 수반하는 이격 훈련 후에 그러한 기계적 자극에 습관화된다 9,10,11. 따라서이 간단한 행동 반응은 비 국소 진동 유발 행동과 기억의 기초가되는 신경 메커니즘을 조사하는 이상적인 시스템을 구성합니다. 비국소 진동의 영향으로 자유롭게 행동하는 웜에서 칼슘 이미징을위한 프로토콜이 설명됩니다. 이전에 보고된 시스템과 비교할 때, 이 시스템은 추적을 위해 추가 카메라가 필요하지 않다는 점에서 간단합니다. 그러나 이를 통해 비국부적 진동의 주파수, 변위 및 지속 시간을 변경할 수 있습니다. AVA 인터뉴런의 활성화는 후진 탈출 반응을 유도하기 때문에, GCaMP, 칼슘 지시약, 및 칼슘-민감하지 않은 형광 단백질인 TagRFP를 공동발현하는 웜을 AVA 특이적 프로모터의 제어 하에 예로 사용하였다(자세한 내용은 표 참조). 이 프로토콜은 웜이 전진에서 후진 운동으로 전환됨에 따라 AVA 뉴런의 활성화를 보여줍니다. 이 프로토콜은 mechanosensory 행동의 기초가되는 신경 회로 메커니즘을 이해하는 것을 용이하게합니다.
Protocol
1. 칼슘 이미징까지 웜 재배 칼슘 이미징 실험 4일 전, 두 개의 성인 ST12 웜을 새로운 선충류 성장 배지(NGM) 플레이트(Table of Materials)로 옮기고, 이 위에 에스케리치아 콜리 OP50이 세포 스프레더를 사용하여 정사각형 패턴(약 4mm x 4mm)으로 줄무늬가 생겨 웜이 칼슘 이미징12 동안 박테리아에서 대부분의 시간을 소비하도록 합니다. 이 NGM 플레이트를 ?…
Representative Results
여기서, AVA 인터뉴런 특이적 프로모터의 제어 하에 GCaMP 및 TagRFP 둘 다를 발현하는 웜은 자유롭게 행동하는 C. elegans에서 칼슘 이미징의 예로서 사용된다. GCaMP 및 TagRFP 채널 데이터는 일련의 이미지로서 획득되었으며, 이들 중 일부는 도 6 및 영화(보충 무비 1)로서 도시되어 있다. 우리의 비국부적 진동 시스템에 의해 유도된 페트리 플레이트의 변위(<strong c…
Discussion
일반적으로, 신경 활동의 정량화는 동물 신체 움직임에 대한 프로브 및/또는 구속의 도입을 필요로 한다. 그러나 mechanosensory 행동에 대한 연구를 위해, 프로브와 구속의 침습적 도입 자체는 기계적 자극을 구성합니다. C. elegans는 그 특징이 투명하고 302 뉴런 만 포함하는 간단하고 컴팩트 한 신경 회로를 가지고 있기 때문에 이러한 문제를 회피하는 시스템을 제공합니다. 이러한 장점들을 나?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 연구에 사용 된 균주를 제공 한 Caenorhabditis Genetics Center에 감사드립니다. 이 간행물은 JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), 혁신적인 분야 “소프트 로봇의 과학”프로젝트 (그랜트 번호. JP18H05474), 일본 의학 연구 개발청 (보조금 번호 19gm6110022h001)의 PRIME 및 Shimadzu 재단.
Materials
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
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Cite This Article
Shigyou, K., Maeoka, H., Igarashi, R., Sugi, T. Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration. J. Vis. Exp. (170), e61626, doi:10.3791/61626 (2021).