İyi Kontrollü, Lokalize Olmayan Titreşimli Serbest Davranan Caenorhabditis elegans'ta Kalsiyum Görüntüleme
Summary
Burada iyi kontrol edilen, lokalize olmayan titreşime sahip serbestçe davranan Caenorhabditis elegans’ta kalsiyum görüntüleme için bir sistem bildirilmiştir. Bu sistem, araştırmacıların nano ölçekli yer değiştirmede iyi kontrol edilen özelliklere sahip lokalize olmayan titreşimleri uyandırmalarını ve C. elegans’ın titreşimlere tepkileri sırasında kalsiyum akımlarını ölçmelerini sağlar.
Abstract
Titreşimler ve akustik dalgalar gibi lokalize olmayan mekanik kuvvetler, gelişimden homeostaza kadar çok çeşitli biyolojik süreçleri etkiler. Hayvanlar, davranışlarını değiştirerek bu uyaranlarla baş ederler. Bu tür davranış değişikliğinin altında yatan mekanizmaları anlamak, ilgilenilen davranış sırasında nöral aktivitenin ölçülmesini gerektirir. Burada, spesifik frekans, yer değiştirme ve sürenin lokalize olmayan titreşimi ile serbest davranan Caenorhabditis elegans’ta kalsiyum görüntüleme için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem, akustik bir dönüştürücü kullanarak iyi kontrol edilen, lokalize olmayan titreşimin üretilmesine ve uyarılmış kalsiyum tepkilerinin tek hücre çözünürlüğünde ölçülmesine izin verir. İlkenin bir kanıtı olarak, C. elegans’ın titreşime kaçış tepkisi sırasında tek bir internöron olan AVA’nın kalsiyum tepkisi gösterilmiştir. Bu sistem, mekanik uyaranlara davranışsal tepkilerin altında yatan nöral mekanizmaların anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.
Introduction
Hayvanlar genellikle titreşimler veya akustik dalgalar gibi lokalize olmayan mekanik uyaranlara maruz kalırlar 1,2. Bu uyaranlar homeostazı, gelişimi ve üremeyi etkilediğinden, hayvanlar onlarla başa çıkmak için davranışlarını değiştirmelidir 3,4,5. Bununla birlikte, bu tür davranış değişikliklerinin altında yatan nöral devreler ve mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır.
Nematoddaki mekanosensoriyel davranış, Caenorhabditis elegans, solucanların genellikle lokalize olmayan titreşimle karşılaştıklarında davranışlarını ileri hareketten geriye doğru kaçış tepkisine değiştirdikleri basit bir davranışsal paradigmadır6. Bu davranışın altında yatan nöral devre öncelikle beş duyusal nöron, dört çift internöron ve çeşitli motor nöron tiplerinden oluşur 7,8. Ek olarak, solucanlar tekrarlanan stimülasyonu içeren aralıklı eğitimden sonra bu tür mekanik uyaranlara alışırlar 9,10,11. Bu nedenle, bu basit davranışsal tepki, hem lokalize olmayan titreşimle uyarılmış davranışın hem de hafızanın altında yatan nöral mekanizmaları araştırmak için ideal bir sistem oluşturur. Lokalize olmayan titreşimlerin etkisi altında serbestçe davranan solucanlarda kalsiyum görüntüleme için bir protokol gösterilmiştir. Daha önce bildirilen sistemlerle karşılaştırıldığında, bu sistem izleme için ek bir kamera gerektirmemesi açısından basittir; ancak, lokalize olmayan titreşimin frekansını, yer değiştirmesini ve süresini değiştirmemize izin verir. AVA internöronlarının aktivasyonu geriye doğru kaçış tepkisini indüklediğinden, bir kalsiyum göstergesi olan GCaMP’yi ve AVA’ya özgü bir promotörün kontrolü altında kalsiyuma duyarlı olmayan bir floresan proteini olan TagRFP’yi birlikte ifade eden solucanlar örnek olarak kullanılmıştır (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). Protokol, bir solucan ileriden geriye doğru harekete geçerken AVA nöronlarının aktivasyonunu gösterir. Bu protokol, mekanosensoriyel davranışın altında yatan nöral devre mekanizmasını anlamayı kolaylaştırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genel olarak, nöral aktivitenin nicelleştirilmesi, bir probun ve / veya hayvan vücudunun hareketine kısıtlamalar getirilmesini gerektirir. Bununla birlikte, mekanosensoriyel davranış çalışmaları için, bir probun ve kısıtlamaların invaziv olarak sokulması mekanik uyaranları oluşturur. C. elegans , bu problemleri atlatmak için bir sistem sağlar, çünkü özellikleri şeffaftır ve sadece 302 nörondan oluşan basit, kompakt bir sinir devresine sahiptir. Bu avantajları, nano ölçekli yer değ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Caenorhabditis Genetik Merkezi’ne bu çalışmada kullanılan suşları sağladığı için teşekkür ederiz. Bu yayın JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) tarafından desteklenmiştir (Hibe no. JP18H02483), Yenilikçi alanlar üzerine “Yumuşak Robot Bilimi” projesi (Hibe no. JP18H05474), Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı’ndan PRIME (hibe numarası 19gm6110022h001) ve Shimadzu vakfı.
Materials
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
- Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
- Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
- Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
- Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
- Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
- Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
- Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
