ГМ-не-ГМ генерация нейрональных клеток, полученных из крови
Summary
Представлен генетически модифицированный (gm-free) метод получения клеток с нейрональным фенотипом из перепрограммированных клеток периферической крови. Активация сигнального пути, связанного с новым человеческим GPI-связанным белком, показывает эффективный безГМ-метод получения плюрипотентных стволовых клеток человека.
Abstract
Многие неврологические расстройства человека вызваны дегенерацией нейронов и глиальных клеток в головном мозге. Из-за ограничений в фармакологических и других терапевтических стратегиях в настоящее время нет доступного лечения для поврежденного или больного мозга. Замена клеток является многообещающей терапевтической стратегией для нейродегенеративных состояний. По сей день нервные стволовые клетки (НСК) успешно генерируются из тканей плода, эмбриональных клеток человека (ЭС) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК). Процесс дедифференциации был инициирован активацией нового человеческого GPI-связанного гликопротеина, который приводит к генерации плюрипотентных стволовых клеток. Эти полученные из крови плюрипотентные стволовые клетки (BD-PSC) дифференцируются in vitro в клетки с нейронным фенотипом, как показано в яркой и иммунофлуоресцентной микроскопии. Ультраструктурный анализ этих клеток с помощью электронной микроскопии подтверждает их примитивную структуру, а также нейроновидную морфологию и субклеточные характеристики.
Introduction
Разработка основных и доклинических методов исследования стволовых клеток способствует клиническому применению терапии на основе стволовых клеток для неврологических заболеваний. Такая потенциальная терапия критически зависит от метода генерации нервных клеток человека, приводящего к функциональномувосстановлению1.
Нервные стволовые клетки (НСК) самообновляются и дифференцируются в новые нейроны на протяжении всей жизни в процессе, называемом взрослым нейрогенезом. Только очень ограниченные области мозга содержат НСК, компетентные генерировать новорожденные нейроны во взрослом возрасте. Такие НСК могут давать начало зрелым нейронам, которые участвуют в обучении и памяти, заменяя таким образом потерянные или поврежденные нейроны. К сожалению, эти НСК присутствуют в ограниченных количествах, и этот ограниченный нейрогенез быстро уменьшается во время развития ювенильнойособи 2. Поэтому другие источники нервных клеток должны учитываться в цели клеточной терапии.
Дегенеративные неврологические заболевания трудно вылечить с помощью стандартных фармакологических подходов. Новые терапевтические стратегии для охвата многих немедикабельных неврологических расстройств основаны на клеточной заместительной терапии больных и поврежденных тканей. Трансплантация NSC может заменить поврежденные клетки и обеспечить полезные эффекты. Другие источники замещения нервных клеток включают эмбриональные стволовые клетки человека (ESC), которые получены из внутренней клеточной массы бластоцист млекопитающих3,а также iPSCs4,которые обладают обширной способностью к самообновлению, как ЭСК, и способны дифференцироваться в различные клеточные линии. НСК также могут генерироваться путем прямого перепрограммирования из фибробластов человека, избегая плюрипотентного состояния5.
Клеточная заместительная терапия по-прежнему является сложной проблемой. Хотя ESC, fetal или iPS могут быть источником генерации нейрональных клеток для лечения многих неизлечимых неврологических заболеваний, аутологичная замена клеток SCs у взрослых поврежденных тканей является лучшей альтернативой, которая обходит иммунологические, этические проблемы и проблемы безопасности.
Активация человеческого GPI-связанного белка путем сшивания антител путем фосфорилирования PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN инициирует дедифференцировку клеток-прогениторов крови и генерацию плюрипотентных стволовых клеток крови (BD-PSC)6. Эти клетки дифференцируются in vitro к нейрональным клеткам, что подтверждается с помощью анализа Brightfield, иммунофлуоресценции и просвечивательной электронной микроскопии (TEM).
В этой работе мы описываем ГМ-свободную генерацию BD-PSC и их успешную редифференцировку в клетки с нейрональным фенотипом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Не-ГМ-метод перепрограммирования клеток человека, описанный в этой работе, основан на активации мембраны в ядро сигнального механизма (механизмов) за гликопротеином человеческой мембраны, связанным с GPI, который инициирует процесс дедифференцировки, приводящий к генерации ex vivo и ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Посвящается памяти доктора Райнера Заффриха.
Авторы особенно благодарны Хосе Мануэлю Гарсиа-Вердуго и Висенте Эррансу-Пересу за проведение экспериментов и анализа ЭМ в Лаборатории сравнительной нейробиологии Института биоразнообразия и эволюционной биологии Каванильеса, Университет Валенсии, CIBERNED, Валенсия, Испания, который был поддержан финансированием исследований из Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Остальная часть этой работы была поддержана ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Германия.
Materials
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
