血液由来神経細胞のGMフリー生成
Summary
我々は、再プログラム化された末梢血細胞から神経表現型を有する細胞を得るための遺伝子組換え非遺伝子組換え(GMフリー)法を提示する。新規ヒトGPI結合タンパク質にリンクされたシグナル伝達経路の活性化は、ヒト多能性幹細胞を得るための効率的なGMフリーの方法を明らかにする。
Abstract
多くの人間の神経疾患は、脳内のニューロンおよびグリア細胞の変性によって引き起こされる。薬理学的および他の治療戦略の制限により、現在、負傷または病気の脳に対して利用可能な治療法はありません。細胞置換は、神経変性状態の有望な治療戦略として表示されます。.今日まで、神経幹細胞(NSC)は、胎児組織、ヒト胚細胞(ES)または人工多能性幹細胞(iPSC)から正常に生成されています。脱分化のプロセスは、多能性幹細胞の生成につながる新しいヒトGPI結合糖タンパク質の活性化によって開始された。これらの血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)は、明視野および免疫蛍光顕微鏡で示されるように、神経表現型を有する細胞に インビトロで 分化する。電子顕微鏡によるこれらの細胞の超構造解析は、その原始構造、ならびに神経細胞様形態および細胞内特性を確認する。
Introduction
基礎的および前臨床幹細胞研究法の開発は、神経疾患に対する幹細胞ベースの治療法の臨床応用を促進する。このような潜在的な治療は、機能回復につながるヒト神経細胞の生成方法に大きく依存する1.
神経幹細胞(NSC)は、成人神経新生と呼ばれるプロセスで、生涯を通じて新しいニューロンに自己更新し、分化します。非常に制限された脳領域だけが、成人期に新生児ニューロンを生成する能力のあるNSCを抱えています。このようなNSCは、学習や記憶に関与する成熟したニューロンを生み出し、失われたニューロンや損傷したニューロンを置き換えることができます。残念ながら、これらのNSCは制限された量で存在し、この限られた神経新生は若年発達中に急速に減少する2。したがって、神経細胞の他の供給源は、細胞治療の目的で考慮されなければならない。
変性神経疾患は、標準的な薬理学的アプローチを用いて治癒することは困難である。多くの薬用神経疾患を受け入れるための新しい治療戦略は、病気および負傷した組織の細胞置換療法に基づいています。NSC移植は、損傷した細胞を置き換え、有益な効果を提供することができます。神経細胞置換の他の供給源としては、哺乳類胚盤胞3の内細胞塊に由来するヒト胚性幹細胞(ESC)や、ESCのような広範な自己再生能力を有し、様々な細胞系統に分化することができるiPSC4が含まれる。NSCはまた、多能状態5を回避するヒト線維芽細胞からの直接再プログラミングによって生成することができる。
細胞補充療法は依然として困難な課題です。ESC、胎児、またはiPSは、多くの不治の神経疾患を治療するための神経細胞の生成源となり得るが、損傷した組織の自己成人SC細胞置換は、免疫学的、倫理的および安全上の懸念を回避するより良い代替手段である。
PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTENのリン酸化による抗体架橋によるヒトGPI結合タンパク質の活性化は、血液前駆細胞の脱分化および血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)6の生成を開始する。これらの細胞は、明視野、免疫蛍光、透過型電子顕微鏡(TEM)解析によって確認されたニューロン細胞に対するインビトロで分化します。
本研究では、GMフリーのBD-PSCの生成と、ニューロン表現型を有する細胞への再分化の成功について述べている。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究で説明されたヒト細胞をリプログラミングする非GM法は、非操作ヒト末梢血から得られた自己再生PSCの 元生体 生成および拡張につながる脱分化のプロセスを開始するGPI結合ヒト膜糖タンパク質の背後にあるシグナル伝達の核活性化に膜に基づいている。これらの細胞は、適切な培地で培養した場合には、異なる生殖層6に属する細胞への再分化が可能である。</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ライナー・サフリッチ博士の記憶に捧げ。
著者らは、比較神経生物学研究所、バレンシア大学CIBERNED、バレンシア、スペイン、プロメテオ・グラント・フォー・エクセレンス・リサーチ・グループPROMETEO/20190/077の研究資金によって支援された比較神経生物学研究所でEM実験と分析を行ったホセ・マヌエル・ガルシア=ヴェルドゥーゴとビセンテ・ヘランツ=ペレスに特に感謝している。この作品の残りの部分は、ACA CELLバイオテクノロジーGmbHハイデルベルク、ドイツによってサポートされました。
Materials
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
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