Summary

ГМ-не-ГМ генерация нейрональных клеток, полученных из крови

Published: February 13, 2021
doi:

Summary

Представлен генетически модифицированный (gm-free) метод получения клеток с нейрональным фенотипом из перепрограммированных клеток периферической крови. Активация сигнального пути, связанного с новым человеческим GPI-связанным белком, показывает эффективный безГМ-метод получения плюрипотентных стволовых клеток человека.

Abstract

Многие неврологические расстройства человека вызваны дегенерацией нейронов и глиальных клеток в головном мозге. Из-за ограничений в фармакологических и других терапевтических стратегиях в настоящее время нет доступного лечения для поврежденного или больного мозга. Замена клеток является многообещающей терапевтической стратегией для нейродегенеративных состояний. По сей день нервные стволовые клетки (НСК) успешно генерируются из тканей плода, эмбриональных клеток человека (ЭС) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК). Процесс дедифференциации был инициирован активацией нового человеческого GPI-связанного гликопротеина, который приводит к генерации плюрипотентных стволовых клеток. Эти полученные из крови плюрипотентные стволовые клетки (BD-PSC) дифференцируются in vitro в клетки с нейронным фенотипом, как показано в яркой и иммунофлуоресцентной микроскопии. Ультраструктурный анализ этих клеток с помощью электронной микроскопии подтверждает их примитивную структуру, а также нейроновидную морфологию и субклеточные характеристики.

Introduction

Разработка основных и доклинических методов исследования стволовых клеток способствует клиническому применению терапии на основе стволовых клеток для неврологических заболеваний. Такая потенциальная терапия критически зависит от метода генерации нервных клеток человека, приводящего к функциональномувосстановлению1.

Нервные стволовые клетки (НСК) самообновляются и дифференцируются в новые нейроны на протяжении всей жизни в процессе, называемом взрослым нейрогенезом. Только очень ограниченные области мозга содержат НСК, компетентные генерировать новорожденные нейроны во взрослом возрасте. Такие НСК могут давать начало зрелым нейронам, которые участвуют в обучении и памяти, заменяя таким образом потерянные или поврежденные нейроны. К сожалению, эти НСК присутствуют в ограниченных количествах, и этот ограниченный нейрогенез быстро уменьшается во время развития ювенильнойособи 2. Поэтому другие источники нервных клеток должны учитываться в цели клеточной терапии.

Дегенеративные неврологические заболевания трудно вылечить с помощью стандартных фармакологических подходов. Новые терапевтические стратегии для охвата многих немедикабельных неврологических расстройств основаны на клеточной заместительной терапии больных и поврежденных тканей. Трансплантация NSC может заменить поврежденные клетки и обеспечить полезные эффекты. Другие источники замещения нервных клеток включают эмбриональные стволовые клетки человека (ESC), которые получены из внутренней клеточной массы бластоцист млекопитающих3,а также iPSCs4,которые обладают обширной способностью к самообновлению, как ЭСК, и способны дифференцироваться в различные клеточные линии. НСК также могут генерироваться путем прямого перепрограммирования из фибробластов человека, избегая плюрипотентного состояния5.

Клеточная заместительная терапия по-прежнему является сложной проблемой. Хотя ESC, fetal или iPS могут быть источником генерации нейрональных клеток для лечения многих неизлечимых неврологических заболеваний, аутологичная замена клеток SCs у взрослых поврежденных тканей является лучшей альтернативой, которая обходит иммунологические, этические проблемы и проблемы безопасности.

Активация человеческого GPI-связанного белка путем сшивания антител путем фосфорилирования PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN инициирует дедифференцировку клеток-прогениторов крови и генерацию плюрипотентных стволовых клеток крови (BD-PSC)6. Эти клетки дифференцируются in vitro к нейрональным клеткам, что подтверждается с помощью анализа Brightfield, иммунофлуоресценции и просвечивательной электронной микроскопии (TEM).

В этой работе мы описываем ГМ-свободную генерацию BD-PSC и их успешную редифференцировку в клетки с нейрональным фенотипом.

Protocol

Этические одобрения были получены при проведении экспериментов. 1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови человека (ПБМНК) Обеспечить, чтобы все доноры подписали информированное согласие до изъятия крови в соответствии с институциональными руковод?…

Representative Results

Результаты свидетельствуют о том, что этот новый метод без ГМО способен возвращать клетки-прародителя крови в их самое примитивное состояние без непосредственного действия на геном человека. Ранее мы показали, что GPI-связанное белковое специфическое сшивание антител ин…

Discussion

Не-ГМ-метод перепрограммирования клеток человека, описанный в этой работе, основан на активации мембраны в ядро сигнального механизма (механизмов) за гликопротеином человеческой мембраны, связанным с GPI, который инициирует процесс дедифференцировки, приводящий к генерации ex vivo и ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Посвящается памяти доктора Райнера Заффриха.

Авторы особенно благодарны Хосе Мануэлю Гарсиа-Вердуго и Висенте Эррансу-Пересу за проведение экспериментов и анализа ЭМ в Лаборатории сравнительной нейробиологии Института биоразнообразия и эволюционной биологии Каванильеса, Университет Валенсии, CIBERNED, Валенсия, Испания, который был поддержан финансированием исследований из Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Остальная часть этой работы была поддержана ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Германия.
 

Materials

Albumin Fraction V Roth T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate Merck Millipore MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 Merck Millipore MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488 Merck Millipore MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 BD Pharmingen 560381
AO/PI Cell Viability kit Biozym 872045 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes Sigma Aldrich A8960-5G
B27 Serum free 50x Fisher Scientific (Gibco) 11530536
Basic FGF solution Fisher Scientific (Gibco) 10647225
Biocoll Merck Millipore L6115-BC density gradient media
BSA Frac V 7.5% Gibco 15260037
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-045-801 nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna Biozym 872010 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek Fisher Scientific 10234121
D-MEM/F12 Merck Millipore FG4815-BC
Durcupan Sigma Aldrich 44610 epoxy resin
FBS Merck Millipore S0115/1030B Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human Fisher Scientific (Gibco) 10679963
GlutaMax 100x Gibco 35050038 L-glutamine
Glutaraldehyde grade Sigma-Aldrich G5882-50ML
Heparin sodium cell Sigma-Aldrich H3149-50KU
Human BDNF Fisher Scientific (Gibco) 11588836
Iscove (IMDM) Biochrom FG0465
Laminin mouse Fisher Scientific (Gibco) 10267092
Lead citrate Sigma-Aldrich 15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter Biozym 872040 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer Miltenyi 130-091-221
MEM NEAA 100x Gibco 11140035
MiniMACS Trennsäulen Miltenyi 130-042-201
Morada digital camera Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells Fisher Scientific 10507591
N2 Supplement 100x Fisher Scientific (Gibco) 11520536
Neurobasal Medium Gibco 10888022
PBS sterile Roth 9143.2
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit FEI Europe
Ultracut UC-6 Leica
Uranyl acetate C EMS 22400

References

  1. Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
  2. Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
  6. Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
  7. Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
  8. Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
  9. Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
  10. Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
  11. Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
  12. Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).

Play Video

Cite This Article
Becker-Kojić, Z. A., Schott, A., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (168), e61634, doi:10.3791/61634 (2021).

View Video