GM-fri generering av blodavledede nevronceller
Summary
Vi presenterer en genetisk modifisert-fri (GM-fri) metode for å skaffe celler med en nevronal fenotype fra omprogrammerte perifere blodlegemer. Aktivering av en signalvei knyttet til nytt humant GPI-tilknyttet protein avslører en effektiv GM-fri metode for å skaffe menneskelige pluripotente stamceller.
Abstract
Mange menneskelige nevrologiske lidelser er forårsaket av degenerasjon av nevroner og glialceller i hjernen. På grunn av begrensninger i farmakologiske og andre terapeutiske strategier, er det for tiden ingen kur tilgjengelig for den skadede eller syke hjernen. Celleerstatning fremstår som en lovende terapeutisk strategi for nevrodegenerative forhold. Til denne dag har nevrale stamceller (NSC) blitt vellykket generert fra fostervev, humane embryonale celler (ES) eller induserte pluripotente stamceller (iPSC). En prosess med dedifferensiering ble initiert ved aktivering av det nye menneskelige GPI-tilknyttede glykoproteinet, noe som fører til generering av pluripotente stamceller. Disse blodavledede pluripotente stamcellene (BD-PSCer) skiller in vitro inn i celler med en nevral fenotype som vist ved brightfield og immunfluorescence mikroskopi. Ultrastrukturell analyse av disse cellene ved hjelp av elektronmikroskopi bekrefter deres primitive struktur samt nevronallignende morfologi og subcellulære egenskaper.
Introduction
Utvikling av grunnleggende og prekliniske stamcelleforskningsmetoder oppmuntrer til klinisk anvendelse av stamcellebaserte terapier for nevrologiske sykdommer. Slik potensiell terapi avhenger kritisk av metoden for generering av menneskelige nevrale celler som fører til funksjonell utvinning1.
Nevrale stamceller (NSC) fornyer seg selv og differensierer seg til nye nevroner gjennom livet i en prosess som kalles voksen neurogenese. Bare svært begrensede hjerneområder har NSC-er som er kompetente til å generere nyfødte nevroner i voksen alder. Slike NSC-er kan gi opphav til modne nevroner, som er involvert i læring og hukommelse, og dermed erstatte tapte eller skadede nevroner. Dessverre er disse NSC-ene til stede i begrensede mengder, og denne begrensede nevrogenesen reduseres raskt under ungdomsutvikling2. Derfor må andre kilder til nevrale celler vurderes i et celleterapimål.
Degenerative nevrologiske sykdommer er vanskelige å kurere ved hjelp av standard farmakologiske tilnærminger. Nye terapeutiske strategier for å omfavne mange uforgjengelige nevrologiske lidelser er basert på celleerstatningsterapier av sykt og skadet vev. NSC-transplantasjon kan erstatte skadede celler og gi gunstige effekter. Andre kilder til nevral celleerstatning inkluderer humane embryonale stamceller (ESC), som er avledet fra den indre cellemassen til pattedyr blastocysts3, samt iPSCs4, som har omfattende selvfornyelseskapasitet som ESC og er i stand til å skille seg ut i ulike celleavstamninger. NSC-er kan også genereres ved direkte omprogrammering fra menneskelige fibroblaster som unngår pluripotent tilstand5.
Celleerstatningsterapi er fortsatt et utfordrende problem. Selv om ESC, foster eller iPS kan være en kilde for generering av nevronceller for behandling av mange uhelbredelige nevrologiske sykdommer, er autolog voksen SCs celleerstatning av skadet vev et bedre alternativ som omgår immunologiske, etiske og sikkerhetsmessige bekymringer.
Aktivering av humant GPI-koblet protein ved antistoff-krysskobling via fosforylering av PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initierer en dedifferensiasjon av blodforfederceller og generering av blodavledede pluripotente stamceller (BD-PSCer)6. Disse cellene skiller in vitro mot nevronceller som bekreftet ved hjelp av brightfield, immunfluorescens og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) analyse.
I dette arbeidet beskriver vi den GM-frie generasjonen av BD-PSCer og deres vellykkede re-differensiering i celler med nevronal fenotype.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ikke-GM-metoden for omprogrammering av menneskelige celler beskrevet i dette arbeidet er basert på membran-til-kjerneaktivering av signalmaskiner bak GPI-tilknyttede humane membranglykoprotein som initierer prosessen med dedifferensiasjon som fører til ex vivo-generasjonen og utvidelse av selvfornyende PSCer hentet fra ikke-manipulert menneskelig perifert blod. Disse cellene når de dyrkes i passende medier, er i stand til å differensiere seg til celler som tilhører forskjellige bakterielag<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dedikert til minnet om Dr. Rainer Saffrich.
Forfatterne er spesielt takknemlige for José Manuel García-Verdugo og Vicente Herranz-Pérez for å utføre EM-eksperimenter og analyse ved Laboratoriet for komparativ nevrobiologi, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spania, som ble støttet av forskningsmidler fra Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Resten av dette arbeidet ble støttet av ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Tyskland.
Materials
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
