اختبار تصوير أحادي الجزيء في المختبر لتحليل حركية الترجمة المعتمدة على الغطاء
Summary
يتيح تتبع أحداث الترجمة الفردية إجراء دراسات حركية عالية الدقة لآليات الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى. هنا نظهر في المختبر اختبار جزيء واحد على أساس التفاعلات التصوير بين الأجسام المضادة وصفت الفلورسنت والببتيدات الناشئة الموسومة epitope. تمكن هذه الطريقة من توصيف جزيء واحد للبدء وحركية استطالة الببتيد أثناء الترجمة النشطة في المختبر المعتمدة على الغطاء.
Abstract
تخليق البروتين المعتمد على الغطاء هو مسار الترجمة السائد في الخلايا النواة. وفي حين سمحت مختلف النهج الكيميائية الحيوية والجينية بإجراء دراسات مستفيضة للترجمة المعتمدة على الحد الأقصى وتنظيمها، لا يزال هناك نقص في التوصيف الحركي عالي الدقة لمسار الترجمة هذا. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير اختبار في المختبر لقياس الحركية الترجمة المعتمدة على الغطاء مع قرار جزيء واحد. ويستند المقايسة على الأجسام المضادة المسمى fluorescently ملزمة لepiptide epitope الموسومة الوليدة. من خلال تصوير ربط وتفكك الأجسام المضادة من وإلى مجمعات الببتيد-ريبوسوم-ميرنا الوليدة، يمكن تتبع تطور الترجمة على الحمض النووي الريبي الفردي. هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء هذا المقايسة، بما في ذلك الاستعدادات الشريحة ميرنا وPEGylated، والتصوير في الوقت الحقيقي للترجمة، وتحليل مسارات جزيء واحد. يتيح هذا الفحص تتبع أحداث الترجمة الفردية المعتمدة على الحد الأقصى ويحل الحركية الرئيسية للترجمة، مثل معدلات البدء والإطالة. يمكن تطبيق المقايسة على نطاق واسع على أنظمة الترجمة المتميزة وينبغي أن تستفيد بشكل عام في الدراسات المختبرية حركية الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى وآليات التحكم في الترجمة.
Introduction
الترجمة في أنظمة eukaryotic يحدث في الغالب من خلال 7-ميثيلguanosine (م7G) مسارات تعتمد على الغطاء1. تشير الدراسات إلى أن الخطوة الأولى للترجمة eukaryotic هو الحد من معدل وهدف مشترك للائحة2،3،4. وقد درست آليات الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى على نطاق واسع باستخدامالوراثية 5، البيوكيميائية6،7،8،الهيكلية 9، والجينومية10 النهج السائبة. وعلى الرغم من أن هذه الأساليب قد حددت آليات متنوعة تنظم البدء المعتمد على الحد الأقصى، فإن حلها يقصرها على مجموعة متوسط الإشارات من أحداث البدء غير المتجانسة وغير المتزامنة. في الآونة الأخيرة ، تم تصور الفردية في أحداث الترجمة في الجسم الحي من خلال الأساليب التي تقيس الأجسام المضادة الفلورية ملزمة لepitopes على polypeptidesالوليدة 11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن هذه النهج الجديدة محدودة أيضا في قدرتها على حل أحداث البدء الفردية لأن الأجسام المضادة الفلورية المتعددة يجب أن تربط الببتيد الوليد للسماح بحل أحداث الترجمة الفردية من خلفية مفلورة عالية داخل الخلايا. في العديد من التفاعلات البيولوجية، قدمت الأحداث الحركية الفردية التي تم حلها رؤى حاسمة لفهم العمليات البيولوجية المعقدة متعددة الخطوات والمتكررة التي لا يمكن مزامنتها على المستوى الجزيئي. هناك حاجة إلى أساليب جديدة يمكنها تتبع ديناميكيات أحداث الترجمة الفردية من أجل فهم أفضل للبدء والتنظيم المعتمدين على الحد الأقصى.
قمنا مؤخرا بتطوير اختبار في المختبر يقيس الحركية بدء تعتمد على الغطاء مع قرار جزيء واحد15. وبالنظر إلى العدد الكبير من عوامل البروتين المعروفة وغير المعروفة المشاركة في مسار البدء هذا3،16، تم تطوير المقايسة أحادية الجزيء لتكون متوافقة مع أنظمة الترجمة الخالية من الخلايا المختبرية الحالية للاستفادة من الحفاظ على العوامل الخلوية ونشاط الترجمة القوي17و18و19و20و21و22و23و24و25. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام نظم الترجمة الخالية من الخلايا يتيح إجراء مقارنات أكثر توافقا بين الملاحظات أحادية الجزيء والنتائج السائبة السابقة. يوفر هذا النهج تكاملا مباشرا بين الرؤى الحركية الجديدة أحادية الجزيء في الإطار الآلي الحالي للبدء المعتمد على الغطاء. لإنشاء المقايسة أحادية الجزيء، يتم تعديل نظام الترجمة التقليدية الخالية من الخلايا بثلاث طرق: يتم إدخال تسلسل ترميز الظهارة في بداية إطار القراءة المفتوح (ORF) لمراسل مرنا. 3′ نهاية مراسل مرنا هو البيوتينيلات لتسهيل مرنا نهاية الربط إلى سطح الكشف عن جزيء واحد; ويتم استكمال الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لمخرج الترجمة. تتطلب هذه التعديلات فقط تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأساسية والكواشف المتاحة عادة. وعلاوة على ذلك، تحافظ هذه التعديلات وظروف التصوير أحادية الجزيء على الحركية التحريرية لتفاعلات الترجمة السائبة الخالية من الخلايا15.
في هذا المقايسة (الشكل 1), 5′-نهاية توج و 3′-end مراسل biotinylated مرنا هو شلت إلى سطح الكشف streptavidin المغلفة في غرفة تدفق. ثم تمتلئ غرفة التدفق بخليط ترجمة خال من الخلايا تكمله أجسام مضادة تحمل علامة fluorescently. بعد ترجمة مرنا قد حدث لحوالي 30-40 codons المصب من تسلسل epitope26،27، وepitope يخرج من نفق الخروج ريبوسوم ويصبح من السهل الوصول إليها للتفاعل مع الأجسام المضادة المسمى fluorescently. هذا التفاعل سريع والكشف عنه عن طريق تقنيات التصوير الفلوري أحادي الجزيء يتيح تتبع حركية الترجمة بدقة جزيء واحد أثناء الترجمة النشطة الخالية من الخلايا. وينبغي أن يفيد هذا المقايسة على نطاق واسع في الدراسات المختبرية حركية الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى وتنظيمها، ولا سيما بالنسبة للأنظمة التي تعمل بكميات كبيرة في الفحص المختبري.
شرط أساسي لإنشاء هذا المقايسة جزيء واحد هو العمل السائبة الخلية خالية من ترجمة المقايسة، والتي يمكن تحقيقها باستخدام استخراج الترجمة التي هي إما متاحة تجاريا أو أعدت باتباع الأساليب الموصوفة سابقا28. يمكن الحصول على استخراج الترجمة Eukaryotic من خلايا متنوعة، بما في ذلك الفطرية والثدييات والنبات28. للتصوير، يتطلب هذا الفحص مجهر TIRF مجهز بكثافة الليزر غير القادرة وزاوية الحادث، ومرحلة عينة مزودة بمحرك، ونظام سوائل آلي، وجهاز التحكم في درجة الحرارة العينة. هذه المتطلبات هي عامة للتجارب الحديثة في المختبر TIRF جزيء واحد ويمكن تحقيقها بشكل مختلف. تستخدم التجربة المعروضة هنا نظام TIRF من النوع الموضوعي يتكون من المجهر والبرامج والملحقات المتاحة تجاريا والمدرجة جميعها في جدول المواد.
Protocol
Representative Results
Discussion
بالمقارنة مع التجارب النموذجية في المختبر TIRF جزيء واحد، والتصوير جزيء واحد مع المقايسة الموصوفة هنا معقدة بالإضافة إلى ذلك بسبب استخدام استخراج الخلية وتركيز عال من الأجسام المضادة المسمى فلوريا. بالمقارنة مع الممارسة الأكثر شيوعا لجولة واحدة من PEGylation السطح، جولة ثانية من PEGylation (ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة [R01GM121847]؛ مركز سلون كيترينج التذكاري للسرطان (MSKCC) منحة الدعم / المنحة الأساسية (P30 CA008748); ومبادرة MSKCC لعلم الجينوم الوظيفي.
Materials
| 100X oil objective, N.A. 1.49 | Olympus | UAPON 100XOTIRF | |
| Acryamide/bis (40%, 19:1) | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Alkaline liquid detergent | Decon | 5332 | |
| Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) | UCT Specialties, LLC | A0700 | |
| Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD | Andor | DU-897U-CSO-#BV | |
| Andor Solis software | Andor | For controlling the Andor EMCCD | |
| Band-pass filter | Chroma | 532/640/25 | |
| Band-pass filter | Chroma | NF03-405/488/532/635E-25 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio Inc | Biotin-PEG-SVA | |
| Coenzyme A free acid | Prolume | 309-250 | |
| Coolterm software | For controlling the syringe pump | ||
| Desktop computer | Dell | For controlling the microscope, camera, stage, and pump. | |
| Dichroic mirror | Semrock | R405/488/532/635 | |
| Direct-zol RNA microprep 50RNX | Fisher Scientific | NC1139450 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Epoxy | Devcon | 14250 | |
| Firefly luciferin D-Luciferin free acid | Prolume | 306-250 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP1185500 | |
| Hydrogen perioxide | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | |
| Immersion oil | Olympus | Z-81226A | Low auto-fluorescence |
| Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
| MEGASCRIPT T7 Transcription Kit | Thermo fisher | AM1334 | |
| Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope slide | Thermo Scientific | 3048 | |
| Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 | Sigma-Aldrich | A9594 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio Inc | mPEG-SVA-5000 | |
| MS(PEG)4 | Thermo Scientific | 22341 | |
| NaCl (5M) | Thermo Scientific | AM9760G | |
| No 1.5 microscope Cover glass | Fisherband | 12-544-C | |
| Olympus Laser, 532nm 100mM | Olympus digital Laser system | CMR-LAS 532nm 100mW | |
| Olympus TirfCtrl software | Olympus | For controlling the laser intensity and incident angle | |
| Optical table | TMC vibration control | 63-563 | With vibration isolation |
| Phenol chloroform isoamyl alcohol mix | Sigma-Aldrich | 77617-100ml | |
| Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit | Thermo Scientific | 20160 | |
| Potassium hydroxide pellets | Sigma-Aldrich | P1767-500G | |
| Prior motorized XY translation stage | Prior | PS3J100 | |
| Prior PriorTest software | Prior | For controlling the Prior motorized stage | |
| Recombinant RNasin RNase Inhibitor | Promega | N2515 | |
| Stage top Incubator | In vivo scientific (world precision Instruments) | 98710-1 | With a custom built acrylic cage |
| Staining jar | Fisher Scientific | 08-817 | |
| Streptavidin | Thermo Scientific | 43-4301 | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300212 | |
| SYBR green II | Fisher Scientific | S7564 | |
| Syringe | Hamilton | 1725RN | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | 55-3333 | |
| Tris (1M), pH = 7.0 | Thermo Scientific | AM9850G | |
| Ultrasonic Bath | Branson | CPX1800H | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Vaccinia Capping system | New England Biolabs | M2080S | |
| Zymo-Spin IC Columns | Zymo Research | C1004 |
References
- Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
- Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
- Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
- Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
- Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6 (2020).
- Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
- Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
- Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
- Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
- Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5′ cap, and 3′ poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
- Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
- Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
- Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5′ and 3′ ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
- Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
- Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
- Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24 (2019).
- Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
- Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
- Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
- Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
- Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
- Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
- Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
- Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
- Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
- Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
- White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357 (2020).
- Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
- Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
- Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).
