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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Published: September 15, 2020 doi: 10.3791/61648
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Das Nachverfolgen einzelner Übersetzungsereignisse ermöglicht hochauflösende kinetische Studien von kappenabhängigen Translationsmechanismen. Hier zeigen wir einen in vitro Einzelmolekül-Assay basierend auf bildgebenden Wechselwirkungen zwischen fluoreszierend markierten Antikörpern und epitopmarkierten aufkommenden Peptiden. Diese Methode ermöglicht die Einzelmolekülcharakterisierung der Initiations- und Peptiddehnungskinetik während der aktiven in vitro capabhängigen Translation.

Abstract

Die cap-abhängige Proteinsynthese ist der vorherrschende Translationsweg in eukaryotischen Zellen. Während verschiedene biochemische und genetische Ansätze umfangreiche Studien über die kapabhängige Übersetzung und ihre Regulierung ermöglicht haben, fehlt es noch immer an einer hochauflösenden kinetischen Charakterisierung dieses Übersetzungswegs. Kürzlich haben wir einen In-vitro-Assay entwickelt, um die capabhängige Translationskinetik mit Einzelmolekülauflösung zu messen. Der Test basiert auf fluoreszierend gekennzeichneten Antikörperbindungen an entstehendes Epitop-markiertes Polypeptid. Durch die Abbildung der Bindung und Dissoziation von Antikörpern an und von entstehenden Peptid-Ribosome-mRNA-Komplexen kann die Translationsprogression auf einzelnen mRNAs nachverfolgt werden. Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung dieses Assays vor, einschließlich mRNA- und PEGylated-Diapräparate, Echtzeit-Bildgebung der Translation und Analyse einzelner Molekülbahnen. Dieser Test ermöglicht die Verfolgung einzelner capabhängiger Übersetzungsereignisse und löst wichtige Translationskinetik, wie Initiierungs- und Dehnungsraten. Der Assay kann in großem Umfang auf unterschiedliche Übersetzungssysteme angewendet werden und sollte im Großen und Ganzen In-vitro-Studien über capabhängige Translationskinetik und translationale Kontrollmechanismen profitieren.

Introduction

Die Übersetzung in eukaryotischen Systemen erfolgt überwiegend über 7-Methylguanosin (m7G) kappenabhängige Wege1. Studien zeigen, dass der Initiationsschritt der eukaryotischen Übersetzung die Rate begrenzend ist und ein gemeinsames Ziel für regulation2,3,4ist. Mechanismen der kappenabhängigen Übersetzung wurden ausgiebig mit genetischen5, biochemischen6,7,8, strukturellen9und genomischen10 Massenansätzen untersucht. Obwohl diese Methoden verschiedene Mechanismen identifiziert haben, die die capabhängige Initiation regulieren, beschränkt ihre Auflösung sie auf die Ensemble-Mittelung von Signalen aus heterogenen und asynchronen Initiationsereignissen. In jüngerer Zeit wurden einzelne In-vivo-Translationsereignisse mit Methoden visualisiert, die die fluoreszierende Antikörperbindung an Epitope auf aufkeimenden Polypeptiden11,12,13,14messen. Diese neuen Ansätze sind jedoch auch in ihrer Fähigkeit eingeschränkt, einzelne Initiationsereignisse zu lösen, da mehrere fluoreszierende Antikörper ein aufkeimendes Peptid binden müssen, damit einzelne Translationsereignisse aus einem hohen intrazellulären Fluoreszenzhintergrund gelöst werden können. In vielen biologischen Wechselwirkungen haben gelöste einzelne kinetische Ereignisse kritische Einblicke in das Verständnis komplexer mehrstufiger und sich wiederholender biologischer Prozesse geliefert, die auf molekularer Ebene nicht synchronisiert werden können. Neue Methoden, die die Dynamik einzelner Übersetzungsereignisse nachverfolgen können, sind für ein besseres Verständnis der cap-abhängigen Initiierung und Regulierung erforderlich.

Kürzlich haben wir einen In-vitro-Test entwickelt, der die cap-abhängige Initiationskinetik mit der Einmolekülauflösung15misst. Unter Berücksichtigung der großen Anzahl bekannter und unbekannter Proteinfaktoren, die an diesem Initiationsweg beteiligt sind3,16, wurde der Einzelmolekül-Assay entwickelt, um mit bestehenden in vitro zellfreien Übersetzungssystemen kompatibel zu sein, um von ihrer Erhaltung zellulärer Faktoren und robuster Translationsaktivität17,18,19,20,21,22,23,24,25zu profitieren. Darüber hinaus ermöglicht der Einsatz zellfreier Übersetzungssysteme kompatiblere Vergleiche zwischen Einzelmolekülbeobachtungen und früheren Massenergebnissen. Dieser Ansatz ermöglicht eine geradlinige Integration neuer kinetischer Einzelmoleküleinblicke in den bestehenden mechanistischen Rahmen der kappenabhängigen Initiation. Um den Einzelmolekül-Assay zu etablieren, wird das traditionelle zellfreie Übersetzungssystem auf drei Arten modifiziert: Zu Beginn des offenen Leserahmens (ORF) eines Reporters mRNA wird eine epitopkodiende Sequenz eingefügt; das 3-Zoll-Ende der Reporter-mRNA ist biotinyliert, um mRNA-End-Tethering-zu-Einmolekül-Detektionsfläche zu erleichtern; und fluoreszierend gekennzeichnete Antikörper werden zum Translationsextrakt ergänzt. Diese Modifikationen erfordern nur grundlegende molekularbiologische Techniken und allgemein verfügbare Reagenzien. Darüber hinaus bewahren diese Modifikationen und die einmolekularen Bildbedingungen die Translationskinetik von massenzellfreien Translationsreaktionen15.

In diesem Test (Abbildung 1), 5'-End-gekapselter und 3'-End-biotinylierter Reporter mRNA wird zu einer Streptavidin-beschichteten Detektionsfläche in einer Strömungskammer immobilisiert. Die Durchflusskammer wird dann mit einem zellfreien Translationsgemisch gefüllt, das mit fluoreszierend gekennzeichneten Antikörpern ergänzt wird. Nachdem die mRNA-Translation für ca. 30-40 Codons unterhalb der Epitopsequenz26,27erfolgt ist, entsteht das Epitop aus dem Ribosom-Ausgangstunnel und wird zugänglich, um mit fluoreszierend markierten Antikörpern zu interagieren. Diese Wechselwirkung ist schnell und ihre Detektion durch einzelmolekulare Fluoreszenz-Bildgebungstechniken ermöglicht die Verfolgung der Translationskinetik mit Einzelmolekülauflösung während der aktiven zellfreien Translation. Dieser Test sollte im Großen und Ganzen In-vitro-Studien zur kapabhängigen Translationskinetik und ihrer Regulierung zugute kommen, insbesondere für Systeme mit einem in vitro-basierten Massentest.

Eine Voraussetzung für die Etablierung dieses einzelmolekularen Assays ist ein massengangfreies Translations-Assay, das mit einem Übersetzungsextrakt erreicht werden kann, der entweder kommerziell erhältlich ist oder nach zuvor beschriebenen Methoden28hergestellt wird. Eukaryotische Translation Extrakt kann aus verschiedenen Zellen gewonnen werden, einschließlich Pilz, Säugetier, und Pflanze28. Für die Bildgebung benötigt dieser Test ein TIRF-Mikroskop mit einstellbarer Laserintensität und Einfallswinkel, eine motorisierte Probenstufe, ein motorisiertes Fluidiksystem und ein Probentemperaturregelgerät. Solche Anforderungen sind generisch für moderne In-vitro-Einzelmolekül-TIRF-Experimente und können unterschiedlich erreicht werden. Das hier vorgestellte Experiment verwendet ein objektives TIRF-System, das aus handelsüblichen Mikroskopen, Software und Zubehör besteht, die alle in der Tabelle der Materialienaufgeführt sind.

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Protocol

1. Generierung von Reporter mRNA

  1. Ändern Sie eine DNA-Transkriptionsvorlage, die einen "unmarkierten" Reporter mRNA mit Massentest kodiert, indem Sie eine N-terminus-Epitop-Tag-Codierungssequenz einfügen, um eine DNA-Transkriptionsvorlage für einen "markierten" Reporter mRNA zu generieren (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Für diesen Test wird aufgrund seiner überlegenen Empfindlichkeit und der kurzen 3xFLAG-Tag-Länge eine 3xFLAG/Anti-FLAG-Interaktion empfohlen. Der Assay ist jedoch mit anderen Epitop-/Antikörperpaaren kompatibel.
  2. Synthetisieren Sie nicht markierte und markierte RNAs mit linearisierten DNA-Vorlagen und einem In-vitro-Transkriptionskit (siehe Tabelle der Materialien). Typischerweise reichen 10–20 pmol in vitro transkribierte RNA für eine nachfolgende RNA-Verarbeitung aus, um eine systematische Einzelmolekül-Studie zu ermöglichen.
  3. Cap the RNA 5' end (Abbildung 2B) mit einem m7G-Verschlusssatz (siehe Materialtabelle) folgensiebe der Empfehlung des Herstellers.
  4. Biotinylatieren Sie das RNA-3-Ende (Abbildung 2B) mit einem Biotinylierungskit (siehe Materialtabelle) gemäß dem mit dem Kit gelieferten Protokoll. Reinigen Sie RNAs durch Phenol-Chlorform-Extraktion, gefolgt von der Reinigung mit einer Spin-Säule. Elute-RNA in 10–20 l RNase-freiem Wasser. Ungefähr 40–50% der nicht gekapselten Eingangs-RNA wird zurückgewonnen.
  5. Bewerten Sie die RNA-Integrität und -Konzentration durch Denaturierung von Acrylamid-Gelelektrophorese und RNA-Färbung, wie zuvorbeschrieben 29.
  6. Führen Sie die massenhaft zellfreie Übersetzung30 mit dem 3-End-Biotinyl-Tag-Reporter mRNA durch, um zu bestätigen, dass die modifizierte mRNA die von Interesse interessierten Übersetzungseigenschaften bewahrt. Beispielsweise kann die kappenabhängige Übersetzung durch Die Messung und den Vergleich von Reporteraktivitäten in massenfreien zellfreien Übersetzungsreaktionen mit nicht gekapselten und gedeckelten Reporter-mRNAs bestätigt werden (siehe repräsentative Ergebnisse).

2. Strömungskammervorbereitung

  1. Wählen Sie eine geeignete Deckbedeckungsdicke aus, die im Objektiv-Spezifikationsblatt des Mikroskops angegeben ist. Wählen Sie ein Glas- oder Quarzschlitten für objektive oder prismate Gesamtreflexionsfluoreszenz (TIRF) Bildgebungssysteme31aus.
  2. Führen Sie Die Reinigung, Versalzung, PEGylation und Kammermontage von Decksch- und Dianachweise nach dem von Chandradoss et al.32 beschriebenen Protokoll mit den folgenden Änderungen durch.
    1. Waschschlitten mit gebohrten Löchern in 10% alkalischem Flüssigwaschmittel (v/v) für 20 min mit Beschallung. Kombinieren Sie die Folien und Abdeckungen für alle verbleibenden Reinigungsschritte.
    2. Überspringen Sie den Aceton-Waschschritt. Verlängern Sie die Inkubationszeit der Piranha-Radierung von 20 min auf 1 h. Inkubieren Sie die erste Runde PEGylation für 3 h. Inkubieren Sie die zweite Runde PEGylation mit MS(PEG)4 für 3 h.

3. Gerätevorbereitung

  1. Mindestens 3 h vor der Durchführung eines Einzelmolekülexperiments, schalten Sie den Mikroskop-Inkubator ein und reduzieren Sie den Luftstrom auf eine niedrige Rate, um übermäßige akustische Störungen von Experimenten zu vermeiden. Stellen Sie die Inkubatortemperatur für das zellfreie Übersetzungssystem auf die optimale Temperatur.
    HINWEIS: Die Übersetzung ist extrem temperaturempfindlich. Die optimale Reaktionstemperatur ist für jedes Zellextraktionssystem spezifisch. Die Charakterisierung der Reaktionstemperatur ist ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung eines massenhaft zellfreien Übersetzungssystems. Dieser Einzelmolekül-Assay sollte unter der gleichen optimalen Temperatur wie der entsprechende Massenübersetzungszustand durchgeführt werden.
  2. Mindestens 1 h vor einem Einzelmolekül-Experiment schalten Sie den Laser ein, indem Sie den Laser-Power-Taste hinter der Laserbox drücken, die Lasersicherheitstaste drehen und den Startknopf drücken; Schalten Sie das Mikroskop ein und tippen Sie auf das Touchscreen-Bedienfeld, um den Bildverarbeitungsmodus, das Objektiv und den Filtersatz auszuwählen.
  3. Schalten Sie die EMCCD-Kamera, den Prior-Stage-Controller und die Spritzenpumpe ein, indem Sie ihre Netztasten drücken. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Software Andor Solis (Software 1), um die EMCCD-Kamera zu steuern, TirfCtrl (Software 2), um den Laser zu steuern, PriorTest (Software 3) zur Steuerung der motorisierten Stufe und Coolterm zur Steuerung der Spritzenpumpe. Lassen Sie die Kamera abkühlen und stabilisieren Sie sich auf die angegebene Arbeitstemperatur, bevor die Datenerfassung beginnt.
  4. Bestätigen Sie in Software 2, dass die richtigen Parameter für Laserwellenlänge, Objektivtyp und Brechungsindex von Glas und Probe festgelegt sind. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verbinden. Um die Laserintensität einzustellen, klicken Sie auf die Schaltfläche Steuerung neben der Laserwellenlänge, dann ziehen Sie im Pop-up-Fenster der Lasersteuerung die Intensitätsschiebeleiste. Stellen Sie den Laser auf den gewünschten Winkel ein, indem Sie die Faserpositionsschiebestange ziehen oder die entsprechende Eindringtiefe eingeben. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Shutter aktiviert ist, um den Laser im Aus-Modus zu halten, wenn er nicht geographiert wird.
    HINWEIS: Öffnen und schließen Sie den Laserverschluss, indem Sie das Shutter-Feld aktivieren. Bei der anfänglichen Ermittlung des Assays sollten verschiedene Laserintensitäten und Einfallswinkel auf eine optimale Einzelmoleküldetektion getestet werden. Die optimale Laserintensität gleicht helle Einmolekülfluoreszenz und schnelle Photobleichung der Fluorophore aus. Der Einfallwinkel sollte über den kritischen Winkel hinaus erhöht werden, um den hohen fluoreszierenden Hintergrund von den diffundierenden markierten Antikörpern zu reduzieren, bis mRNA-gebundene Antikörper eindeutig aufgelöst sind. Als Referenz wurde ein 532 nm-Laser am Objektiv auf 10 W eingestellt, wobei der Lasereinfallswinkel in einer Studie15 unter Verwendung von Cy3-beschrifteter Anti-FLAG mit einem Beschriftungsverhältnis von 2–7 Farbstoffen pro Antikörper auf 71,5° eingestellt wurde.
  5. Wählen Sie in Software 1 Kinetik unter dem Erfassungsmodusaus , geben Sie die Parameter für Belichtungszeit, kinetische Reihenlänge und EM-Verstärkungswert ein. Wählen Sie das Verzeichnis aus, und weisen Sie Dateinamen zum Speichern der Datenabbilddatei zu.
  6. Stellen Sie die Spritzenpumpe für den nachfolgenden Schlauchwaschschritt auf eine bescheidene bis schnelle Durchflussrate ein.
    Pipette ein Aliquot von 70% Ethanol in ein Mikrofugerohr, legen Sie die Spritzenpumpe Schlauchende in die Ethanol-Lösung, und verwenden Sie Coolterm, um die Spritzenpumpe zwischen Rückzug und Abgabe Modi dreimal zu schalten, um die Schläuche zu waschen. Wiederholen Sie dies mit RNase-freiem Wasser.
    HINWEIS: Die Rohrlänge muss lang genug sein, damit die Übersetzungsmischung in Schritt 5 abgegeben werden kann, um nur den Schlauch und nicht die Spritze zu kontaktieren. Das Spülvolumen sollte hier größer sein als das Volumen des abgegebenen Übersetzungsmixes, um sicherzustellen, dass der Übersetzungsmix bei Schritt 5 in Kontakt mit desinfizierten Schläuchen bleibt.
  7. Nachdem die endgültige Wasserspülung abgegeben wurde, entfernen Sie Restwasser aus dem Inneren des Schlauches, indem Sie das Rohrende auf ein sauberes Gewebewischen kleben. Halten Sie das Schlauchende trocken, indem Sie es in ein sauberes Mikrofugenrohr stellen.

4. Immobilisierung von 3-End-biotinylierte mRNA

  1. Bewahren Sie den Zellextrakt und die Übersetzungsmischung auf Trockeneis eingefroren bis kurz vor ihrer Verwendung. Die restlichen gefrorenen Reagenzien auftauen und auf Eis pflegen.
  2. Legen Sie die Durchflusskammer in den Mikroskopprobenhalter mit der abdeckungsrutschenden Seite nach unten und befestigen Sie sie mit Klebeband. Verwenden Sie Klebeband, um die Ein- und Auslässe von Strömungskanälen abzudecken, die nicht verwendet werden.
  3. Pipette ein 1,5-faches Volumen (bezogen auf das Kanalvolumen; gilt auch für andere Schritte in Schritt 4 und Schritt 5) von 0,2 mg/ml Streptavidin in den Durchflusskanal und inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur.
  4. Um ungebundenes Streptavidin zu entfernen, waschen Sie den Kanal dreimal, indem Sie das 3x Volumen des T50-Waschpuffers (20 mM Tris HCl, pH 7,0, 50 mM NaCl, 0,2 U/L RNase-Inhibitionsreagenz) pro Waschmittel einleiten.
    HINWEIS: Es ist wichtig, zu verhindern, dass flüssige Abfälle in den Kanal zurückfließen. Wenn der Auslass des Strömungskanals nicht mit einem Abfallsammelrohr verbunden ist, legen Sie ein gefaltetes Gewebepapier in die Nähe des Auslasses, um die Flüssigkeit zu absorbieren, die aus dem Kanal fließt.
  5. Den Übersetzungsextrakt übertragen und von Trockeneis auf Eis mischen und auftauen lassen.
  6. Setzen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Ziel. Legen Sie den Mikroskopprobenhalter mit der Durchflusskammer in die Mikroskopstufe. Bringen Sie das Objektiv in die Nähe des Deckels, bis Tauchöl auf das Objektiv den Deckschein kontaktiert. Verschieben Sie die Probenstufe so, dass sich die Position des Strömungskanals direkt über der Objektivlinse befindet.
  7. Öffnen Sie in Software 2 den Laserverschluss und passen Sie den Laserintensitätspegel an.
  8. Wählen Sie auf dem Touchscreen der Mikroskopsteuerung die Registerkarte Fokus und klicken Sie auf die Schaltfläche Suchen und Starten des Mikroskops. Ein Piepton ist zu hören, wenn eine Fokusebene erfolgreich erreicht wird.
  9. Bildn die Strömungskanaloberfläche im Live-Modus in Software 1. Optimieren Sie den Fokus für ein schärferes Bild, indem Sie die Objektivposition mit der Feinschrittsteuerung auf dem Touchscreen anpassen.
  10. Verschieben Sie in Software 3 die Stufe, um den Fluoreszenzhintergrund an verschiedenen Bereichen der Strömungskanalerkennungsoberfläche zu bewerten. Wenn die Fluoreszenz niedrig ist, fahren Sie mit dem Experiment fort. Wenn der Fluoreszenzhintergrund zu hoch ist, sollten Sie den Strömungskanal verwerfen.
  11. Schließen Sie in Software 2 den Laserverschluss.
  12. Pipetten Sie den T50 Waschpuffer aus dem Durchflusskanal und sofort Pipette in einem 2x Volumen der biotinylierten mRNA-Lösung in den Durchflusskanal. 15 min inkubieren.
    HINWEIS: Für jede Charge der mRNA-Vorbereitung sollten mRNA-Konzentrationen und Inkubationszeiten getestet werden, um die für die Einzelmoleküldetektion erforderliche mRNA-Oberflächendichte zu erreichen. Geeignete mRNA-Oberflächendichte-Mediat-Antikörperbindung, die fluoreszierende Flecken mit nicht mehr als 5 % Überlappung zeigt (siehe Repräsentative Ergebnisse). Als Ausgangspunkt wird biotinylierte mRNA in einer Konzentration von 2–20 nM empfohlen.
  13. Waschen Sie den Kanal dreimal, indem Sie einen 3-fachen Übersetzungs-kompatiblen Puffer pro Wäsche pipetieren.

5. Übersetzung stell zur Montage und Lieferung in einen Durchflusskanal zur Einzelmoleküldetektion

  1. Auf Eis 3x Volumen des Translationmix30 in einem Mikrozentrifugenrohr nach dem Massenübersetzungsprotokoll ab Schritt 1.7 zusammenstellen, außer mRNA weglassen und mit einer optimierten Konzentration fluoreszierend markierter Antikörper ergänzen. Drehen Sie das Mikrozentrifugenrohr kurz, um den Übersetzungsmix an der Unterseite des Rohres zu sammeln.
    HINWEIS: Bei der Ermittlung des Tests werden verschiedene Antikörperkonzentrationen getestet. Die optimale Konzentration zeigt geringe Mengen an unspezifischer Antikörperbindung an die Nachweisoberfläche und eine schnelle Antikörperbindung an das entstehende Peptid (siehe Schritte 7.1. bzw. 7.2., für Assay-Kalibrierungsdetails).
  2. Übertragen Sie den Übersetzungsmix auf die Innenseite einer 0,7 ml Mikrofugenrohrkappe. Stellen Sie die Spritzenpumpe in den Rückzugsmodus ein. Setzen Sie das Pumpenrohrende in den Übersetzungsmix ein. Starten Sie den Spritzenentzug, um den Übersetzungsmix in den Pumpenschlauch zu sammeln. Umkehren Sie die Spritzenpumpeneinstellung in den Dosiermodus und stellen Sie den Durchfluss auf eine optimale Rate für die Übersetzungsmix-Lieferung ein.
    HINWEIS: Vermeiden Sie blasen im Übersetzungsmix, wenn Sie ihn in den Pumpenschlauch übertragen. Vermeiden Sie es, die Übersetzungsmischung zu tief in den Teil des Schlauches zurückzuziehen, der in Schritt 3.6 nicht desinfiziert und gespült wurde. Bei der Ermittlung des Tests werden unterschiedliche Fördermengen getestet, um die optimale Rate zu bestimmen (Details zur Assaykalibrierung siehe Schritt 6.2).
  3. Wenn es einen Spalt zwischen dem Schlauchende und dem Übersetzungsgemisch gibt, starten Sie die Spritzenpumpe und lassen Sie das Übersetzungsgemisch das Rohrende erreichen, und stoppen Sie dann die Spritzenpumpe.
  4. Setzen Sie das Pumpenrohrende in den Einlass des Durchflusskanals ein. Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen in den Übersetzungsmix, wenn Sie die Verbindung durchführen. Stabilisieren Sie die Verbindung, indem Sie die kundenspezifische Metallhalterung auf die Probenhalterplatte des Mikroskops schrauben. Bewerten Sie den Mikroskopfokus und die Fluoreszenz des Bildbereichs.
    HINWEIS: Die Schläuche können mit einem kundenspezifischen Teil wie zuvor beschrieben33an die Durchflusskammer geklemmt werden. Für diesen Test können auch andere Arten von Fluidiksystemen verwendet werden34. Das Sichtfeld sollte vor und nach dem Anschluss des Schlauches ähnlich aussehen. Wenn nach der Verbindung mehr fluoreszierende Flecken auftreten, ist der Übersetzungsmix wahrscheinlich aus dem Lieferschlauch ausgetreten. Je nach Anwendung muss der Kanal mit durchgesickertem Übersetzungsmix möglicherweise verworfen werden.
  5. Vergewissern Sie sich, dass die Parameter für die Filmaufnahme korrekt sind und dass der entsprechende Dateiname und das entsprechende Verzeichnis zum Speichern von Dateien eingegeben wurden.
  6. Verschieben Sie die Bühne, um einen Bereich in der Mitte der Strömungskanalerkennungsoberfläche abzubilden. Wählen Sie auf dem Touchscreen der Mikroskopsteuerung die Registerkarte Kontinuierliche AF aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Fokussuche und Start, um die Fokusposition während des Experiments beizubehalten. Ein Piepton ist zu hören, wenn eine Fokusebene erfolgreich erreicht wird.
  7. Öffnen Sie in Software 2 den Laserverschluss. Klicken Sie in Software 1 auf die Schaltfläche Signal nehmen, um die Aufnahme zu starten. Nach ca. 5 s Aufnahme geben Sie den Befehl Ausführen in Coolterm ein, um den Übersetzungsmix in den Flow-Kanal zu liefern. Rekord für bis zu 2 h mit einer Zeitauflösung von 0,5–2 s/Frame.
    HINWEIS: Die maximale Spanne der Datenerfassung hängt davon ab, wie schnell der Translationsextrakt im Laufe der Zeit an Aktivität verliert, was sich durch die Durchführung einer massenzellfreien Übersetzung mit luziferase Reporter mRNA und die Messung der Luziferaseaktivität in den Translationsreaktionen zu verschiedenen Zeitpunkten bequem auszeichnen kann35.
  8. Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, schalten Sie den Laser aus, schalten Sie die Kontinuierliche AF auf dem Touchscreen der Mikroskopsteuerung aus und zerlegen Sie die Schläuche aus der Durchflusskammer.
  9. Pipetten Sie das Übersetzungsgemisch aus dem Durchflusskanaleinlass heraus, übertragen Sie es in ein Mikrofugenrohr und fangen Sie die Lösung ein, indem Sie das Rohr in flüssigen Stickstoff setzen. Später bei -80 °C lagern.
  10. Waschen Sie die Spritzenpumpe dreimal mit RNase-freiem Wasser, dann dreimal mit 70% Ethanol. 70% Ethanol zur Lagerung in den Spritzenpumpenschlauch ziehen.
  11. Schalten Sie das Mikroskop und das gesamte Zubehör aus. Aufräumen.

6. Datenanalyse

HINWEIS: Die Datenanalyse für diesen Test erfordert gemeinsame Methoden in biophysikalischen Einzelmolekülstudien. Alle rechenintensiven Schritte können mit vorhandenen Algorithmen und Software erreicht werden (Referenzen sind unten in den entsprechenden Schritten enthalten).

  1. Optional: Konvertieren Sie ggf. die erfasste Bildseriendatei in ein Format, das mit der gewählten Bildverarbeitungssoftware oder Programmiersprache kompatibel ist.
  2. Bestimmen Sie den Ausgangspunkt der Translationsreaktion und die Austauschzeit des Reagenzien.
    HINWEIS: Aufgrund der diffundierenden fluoreszierenden Antikörper im Translationsmix erhöht sich die Hintergrundfluoreszenzintensität eines abgebildeten Bereichs während des In-Channel-Reagenzienaustauschs vom translationskompatiblen Puffer zum Translationmix. Der Startpunkt der Translationsreaktion wird als Zeitpunkt festgelegt, an dem der Reagenzienaustausch abgeschlossen ist. Dieser Fertigstellungspunkt wird ermittelt, indem die Hintergrundfluoreszenzintensität während der Übersetzungsmixbereitstellung gemessen und der Zeitpunkt ermittelt wird, an dem die steigende Fluoreszenzintensität15,wie unten beschrieben, hochist.
    1. Berechnen Sie die Gesamtfluoreszenzanzahl pro Bildrahmen und zeichnen Sie das entsprechende Zeitprofil. Identifizieren Sie den plötzlichen Anstieg der Gesamtfluoreszenz im Zeitprofildiagramm.
      HINWEIS: Der Gesamtfluoreszenzanstieg ist auf die zunehmende Konzentration fluoreszierend markierter Antikörper während des Reagenzaustauschs zurückzuführen.
    2. Identifizieren Sie den Endpunkt der Gesamtfluoreszenzerhöhungsphase und legen Sie diesen Zeitpunkt als Ausgangspunkt (d. h. Zeit 0) der Übersetzungsreaktion fest. Identifizieren Sie sowohl den Start- als auch den Endpunkt der Gesamtfluoreszenzerhöhungsphase und legen Sie die Zeitdifferenz als Austauschzeit des Reagenzien fest.
      HINWEIS: Die Gesamtzeitspanne des Reagenzienaustauschs hängt von den Durchflusskanaldimensionen und der ausgewählten Durchflussmenge ab. Es ist möglich, dass einige Translationsfaktoren beginnen können, sich an mRNA zu binden, bevor der Reagenzaustausch abgeschlossen ist, was die Auflösung der ermittelten Erstrunden-Initiationszeit reduzieren könnte. Es wird daher empfohlen, beim Einrichten des Assays unterschiedliche Durchflussraten zu testen und Die durchflussmengen auszuwählen, die die Ausführung des Reagenzienaustauschs innerhalb von 3–4 s für Datenerfassungsgeschwindigkeiten von 0,5–2 s/Frame ermöglichen.
  3. Optional: Führen Sie die Filmdriftkorrektur durch.
    HINWEIS: Die Positionen der gebundenen Antikörper im Datenbild können sich im Laufe der Zeit aufgrund der Drift von Mikroskopteilen und Zubehör ändern. Drift, die in einem Film visuell spürbar ist, erfordert eine Korrektur, bevor die Datenanalyse fortgesetzt wird. Mehrere räumliche Drift-Korrektur-Algorithmen und Skripte sind verfügbar36,37,38.
    1. Suchen Sie in jedem Bild die lokale Maxima in Pixelanzahl, um die Positionen gebundener Antikörper in jedem Frame mit Pixel-Level-Genauigkeit zu bestimmen. Legen Sie einen Schwellenwert für die Pixelanzahl fest, sodass nur Punkte ausgewählt werden, die deutlich über dem Hintergrundrauschen liegen.
    2. Berechnen Sie die Änderungen der einzelnen Antikörperpositionen in jeder Richtung zwischen zwei aufeinander folgenden Bildrahmen.
    3. Zeichnen Sie das Histogramm der Antikörperpositionsänderungen zwischen zwei aufeinander folgenden Frames und tun Sie dies separat für jede Richtung. Gaußisch passen jedes Histogramm und legen die mittlere Position der Spitzen als Richtungsdrift zwischen zwei aufeinander folgenden Frames.
    4. Um der beobachteten Drift entgegenzuwirken, verschieben Sie jeden Bildrahmen in die entgegengesetzte Richtung um die berechnete Driftmenge.
  4. Konstruieren Sie einzelne Molekülbahnen.
    HINWEIS: Erkennungs-/Tracking-Software ist verfügbar, um helle Flecken zu identifizieren und ihre Intensitäten aus der Datenbildserie39,40zu extrahieren.
    1. Identifizieren Sie Antikörperpositionen, wie in Schritt 6.3.1 beschrieben.
      HINWEIS: Es wird eine visuelle Inspektion empfohlen, um sicherzustellen, dass der gewählte Schwellenwert nicht zu einer übermäßigen Über- oder Unterernte von Partikeln führt. Die visuelle Inspektion kann erreicht werden, indem die identifizierten Schwerpunktpositionen über jeden Bildrahmen überlagert und ihre Zustimmung visuell bewertet wird (siehe Repräsentative Ergebnisse).
    2. Kombinieren Sie die entnommenen Partikel aus allen Frames und entfernen Sie die redundanten Partikelpositionen.
    3. Überprüfen Sie visuell die Bilder gebundener Antikörper und wählen Sie einen quadratischen Bereich aus, der die Pixel mit Zahlen umschließt, die deutlich über dem Hintergrund liegen und für individuell gebundene Antikörper repräsentativ sind.
      HINWEIS: Die Punktstreufunktion (d. h. die Größe des Quadrats für ein einzelnes Molekül) wird durch das optische Setup und die Pixelgröße des Detektors bestimmt.
    4. Erstellen Sie für jede Partikelposition eine einmolekulare Flugbahn, indem Sie die Gesamtintensität aller Pixel im quadratischen Bereich um die Partikelposition berechnen. Trajektorien werden für jede Position, Frame für Frame und für den gesamten Datenfilm erstellt.
  5. Optional: Wenden Sie einen nichtlinearen Vorwärts-Rückwärtsfilter41 an, um Hintergrundgeräusche in Einzelnenmolekül-Trajektorien zu reduzieren.
  6. Optional: Digitalisierung von Flugbahnen mit vorhandenen Schritterkennungsalgorithmen42,43,44,45.
    HINWEIS: Die Wahl des Schritterkennungsalgorithmus hängt von der Komplexität der Einzelmoleküldynamik ab. Für das einfachste Szenario der einzigen isolierten Ribosom-Translation (d.h. keine Polysomenbildung) und eines guten Signal-Rausch-Verhältnisses reicht eine Schwellenanwendung auf die Fluoreszenzzählungen aus, um den Zeitpunkt der Antikörperbindung und Dissoziationsereignisse in den Einmolekülbahnen zu identifizieren. Es wird empfohlen, mindestens 100 Flugbahnen für jede Bedingung zu prüfen, um sicherzustellen, dass die Trajektorienschritte durch eine Schritterkennungsstrategie entsprechend ausgewählt wurden.
  7. Bestimmen Sie die Zeit des ersten Antikörperbindungsereignisses für jede Flugbahn (d. h. erstankunftszeit, t1), entweder mithilfe digitalisierter Flugbahnen oder der Anwendung eines Schwellenwerts auf nicht digitalisierte Flugbahnen.
    HINWEIS: Der Medianwert der ersten Ankunftszeitverteilung kann zwischen verschiedenen Übersetzungsbedingungen verglichen werden. Alternativ kann die erste Ankunftszeitverteilung an eine verschobene (3-Parameter) log-normale Funktion angepasst werden, um den Mittelwert15 <t1> zu bestimmen. Da die erste Ankunftszeitverteilung in der Regel verzerrt ist und einen langen Schwanz hat, berechnen Sie den Mittelwert nicht direkt durch eine direkte Mittelung über den beobachteten ersten Ankunftszeiten.
  8. Optional: Verweilzeitanalyse und Berechnung der durchschnittlichen Peptidsyntheserate.
    1. Verwenden Sie digitalisierte Flugbahnen, um monosome (einzelne Ribosom) Übersetzungsereignisse in jeder Flugbahn zu identifizieren und die einzelnen Bindungsereignisse als Zeitdifferenz zwischen entsprechenden Antikörperbindungs- und Dissoziationsereignissen zu berechnen.
      HINWEIS: Schritterkennungsalgorithmen für die Digitalisierung von Flugbahnen sind im Allgemeinen weniger zuverlässig, wenn sich mehrere molekulare Ereignisse zeitlich überlappen. Daher wird empfohlen, Polysomenereignisse von der Verweilzeitanalyse auszuschließen. Bei hochaktiven Übersetzungssystemen, die mit Polysomenereignissen angereichert sind und selten monosome-Ereignisse anzeigen, kann eine Mischung aus markierten und unbeschrifteten Antikörpern verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, isolierte Translationsereignisse in Einmolekülbahnen zu beobachten.
    2. Passen Sie die Verteilung an eine log-normale Funktion an und verwenden Sie die angepasste Funktion, um die durchschnittliche Verweilzeit zu berechnen.
      HINWEIS: Die direkte Berechnung des Mittelwerts durch Mittelung der beobachteten Verweilzeiten wird nicht empfohlen, da die Verweilzeitverteilungen in der Regel mit langen Schwänzen verzerrt sind.
    3. Bestimmen Sie die Anzahl der Aminosäuren, die während der Antikörperbindungszeit übersetzt werden, indem Sie die Summe der Epitop-Aminosäurelänge und 35 (die durchschnittliche Aminosäurelänge des entstehenden Peptids innerhalb des Ribosom-Ausgangstunnels) von der Gesamtzahl der ORF-Codons subtrahieren.
    4. Um die durchschnittliche Peptidsyntheserate zu bestimmen, dividieren Sie die Anzahl der übersetzten Aminosäuren durch die durchschnittliche Verweilzeit.
  9. Optional: Berechnung der durchschnittlichen Erstrunden-Einweihungszeit (<t1_I>).
    HINWEIS: Initiations- und Dehnungsbedingungen, wie z. B. der Sequenzkontext der Initiationsstelle und die Codierungssequenz, werden in der Regel absichtlich für Studien der Initiationskinetik beibehalten. Daher die durchschnittliche Erstankunftszeit <t1> ab Schritt 6.7. kann direkt verwendet werden, um die Veränderung der Ersten-Runden-Initiationskinetik zwischen verschiedenen Bedingungen zu berechnen. Die folgende Korrektur ist nur zur Bestimmung des tatsächlichen Wertes der Erstrunden-Einweihungszeit erforderlich.
    1. Teilen Sie die Summe der Epitoplänge und 35 (die durchschnittliche Aminosäurelänge des entstehenden Peptids innerhalb des ribosomigen Ausgangstunnels) durch die durchschnittliche Peptidsyntheserate (ab Schritt 6.8.4.), um die durchschnittliche Peptiddehnungszeit dieser N-Terminal-Region zu berechnen (<t1_tag>).
    2. Da die erste Ankunftszeit die Summe der Erstrunden-Einweihungszeit und t1_tagist, subtrahieren <t1_tag> von der durchschnittlichen erstanreisezeit <t1> um die durchschnittliche Erstrunden-Einweihungszeit zu berechnen <t1_I>: <t1_I> = <t1>1_tag-

7. Assay-Kalibrierung

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Kalibrierungsschritte aus, wenn Sie den Test zunächst einrichten.

  1. Um die Bindungsspezifität des Antikörpers zu untersuchen, führen Sie die Protokollschritte in den Abschnitten 4 und 5 separat für nicht markierte und markierte mRNAs aus (Abbildung 2). Die Antikörperbindungswerte in Kanälen mit diesen jeweiligen mRNAs stellen den Umfang der unspezifischen Antikörperbindung an die Nachweisoberfläche und die spezifische Antikörperbindung an das entstehende Peptid dar.
    HINWEIS: Das spezifische bis unspezifische Bindungsverhältnis wird empfohlen, >10 zu sein und kann mit unterschiedlichen Oberflächenpassivierungsstrategien, geringerer Antikörperkonzentration oder höherer mRNA-Oberflächendichte erhöht werden.
  2. Um die Rate der Antikörperbindung zu messen, führen Sie das Protokoll mit einem zusätzlichen Schritt zwischen Schritt 4 und Schritt 5 aus.
    1. Nach Schritt 4, inkubieren Sie den Kanal mit Translationsmischung, die Antikörper fehlt, um mRNA/Ribosom/Peptid-Komplexe vorzuerzeugen.
    2. Fahren Sie dann mit Schritt 5 fort und fließen Sie durch die durchgedrungene Übersetzungsmischung in den Kanal.
    3. Quantifizieren Sie die durchschnittliche Antikörperbindungsrate an vorerzeugtes aufkeimendes Peptid mit exponentiellem Anpassen an das erste Histogramm der Ankunftszeit.
      HINWEIS: Die Antikörperbindung an vorerzeugtes Peptid sollte in der Reihenfolge von Sekunden schnell und schneller als die Translationskinetik sein. Eine höhere Antikörperkonzentration kann verwendet werden, um die Antikörperbindungsrate zu erhöhen.
  3. Photostabilität von fluorophor-markiertem Antikörper.
    1. Bereiten Sie eine Folie gemäß dem Protokoll in Schritt 2 vor, überspringen Sie jedoch den PEGylation-Schritt. Montieren Sie die Strömungskammer nach dem Versalzungsschritt. Die Silanbeschichtung ermöglicht eine effiziente unspezifische Antikörperbindung an die Nachweisoberfläche.
    2. Fügen Sie die fluoreszierend markierten Antikörper in den Kanal ein, um eine Einzelmoleküldichte der unspezifischen Antikörperbindung an die Nachweisoberfläche zu erreichen. Beginnen Sie mit fluoreszierend markiertem Antikörper, der im T50-Waschpuffer stark verdünnt ist, und erhöhen Sie schrittweise die Antikörperkonzentration, bis die gewünschte Einzelmoleküldichte erreicht ist.
    3. Stellen Sie die Nachweisfläche so lange ab, bis der größte Teil der Antikörperfluoreszenz nicht mehr nachweisbar ist.
    4. Zeichnen Sie die Gesamtzahl der sichtbaren Antikörper im Laufe der Zeit, um die Rate des Fluoreszenzverlustes von Antikörpern aufgrund von Fluorophor-Photobleichungen zu bewerten.
      HINWEIS: Die Antikörperkennzeichnung ergibt in der Regel mehrere Fluorophore pro Antikörper. Einzelne Antikörper bleiben nachweisbar, bis alle konjugierten Fluorophore Photobleichmittel.

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Representative Results

Das Folgende beschriebene Protokoll ermöglicht die Abbildung einzelner Antikörper-Wechselwirkungen mit entstehenden N-terminal-markierten Polypeptiden mit einzelmolekularer Auflösung während der aktiven zellfreien Translation von 3' End-tethered Reporter mRNA (Abbildung 1). Ein minimales Demonstrationsexperiment wird mit der Verwendung von drei synthetischen mRNAs berichtet: LUC (Codierung nicht markiert luziferase), LUCFLAG (Codierung 3xFLAG-getaggt eifferase) und hp-LUCFLAG (LUCFLAG mit einem stabilen Stamm-Loop in der 5' Leader-Region) (Abbildung 2C). Die Verwendung von luciferase-kodierender mRNA ermöglicht Vergleiche zwischen Einzelmolekülbeobachtungen und Massenlumineszenzmessungen. Die Integrität der 3' biotinylierten mRNA wurde durch Denaturing von Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und RNA-Färbung bewertet. MRNA mit guter Qualität zeigt ein einziges sauberes Band und sollte keine zusätzlichen schnelleren Migrationssignale aufweisen (Abbildung 3A). Saccharomyces cerevisiae Übersetzungsextrakt wurde hier verwendet und nach einem Protokoll erstellt, das zuvor beschrieben wurde30 und modifiziert15. Massenmessungen der Luziferaseaktivität in zellfreien Translationsreaktionen mit dem Hefeextrakt und der biotinylierten LUCFLAG mRNA, die entweder eine m7G Kappe fehlen oder enthält, zeigen die Cap-Stimulation der LUCFLAG mRNA-Translation ( Abbildung3B).

Für die Einzelmolekül-Bildgebung wurde der Translationsextrakt mit 67 nM Cy3-beschrifteten Anti-FLAG-Antikörpern (Cy3-FLAG) ergänzt. Dieser Antikörper hatte ein hohes Etikettierungsverhältnis von 2-7 Farbstoffen pro Antikörper. Der 532 nm-Laser wurde am Ziel auf 10 W eingestellt. Der Lasereinfallswinkel wurde auf 71,5° eingestellt, was für unsere Einrichtung größer war als der kritische Winkel von 63,8°. Ein niedriger Fluoreszenzgehalt wurde von Detektionsoberflächen abgebildet, die mRNA enthalten, aber keinen Übersetzungsmix aufweisen (Abbildung 4A). Bei Kanalabmessungen von ca. 2 mm (Breite) x 50 m (Tiefe) x 24 mm (Länge) ergab eine Durchflussförderrate von 150 l/min eine Reagenzwechselzeit von 3 – 4 s. Innerhalb von 5 s der Übersetzungsmix-Lieferung steigt der Hintergrundfluoreszenzspiegel aufgrund der diffundierenden fluoreszierenden Antikörper. Ungefähr 2 min nach der Übersetzungmix-Lieferung an LUCFLAG mRNA-haltige Kanäle tauchten Cy3-Spots in einem Sichtfeld auf und sammelten sich 30 min lang weiter an (Abbildung 4B). Unspezifische Antikörperbindung an die Oberfläche, gemessen mit der 3xFLAG-fehlenden LUC mRNA (Abbildung 2C), blieb auf einem sehr niedrigen Niveau15. Die Signale von mRNA/Ribosom/Peptid-gebundenem Cy3- -FLAG waren mit dem optimierten Lasereinfallswinkel deutlich sichtbar, konnten aber durch einen hohen Fluoreszenzhintergrund mit niedrigeren Lasereinfallswinkeln maskiert werden (Abbildung 4C).

Um Cy3-FLAG-Bindungsereignisse zu analysieren, wurden die Fluoreszenzintensitäten ausgewählter Cy3-FLAG-Spots (Abbildung 5A) Frame für Frame für den gesamten Film berechnet und dann mit einer Intensitätsbahn verbunden (Abbildung 5B). Rohe Flugbahnen können laut erscheinen und erfordern eine Verfeinerung mit einem nichtlinearen Vorwärts-Rückwärtsfilter, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren41. Eine weitere Verfeinerung könnte mit Step-Detection-Algorithmen erreicht werden, um Trajektorien zu digitalisieren42. Für alle Bahnen erscheint während des Reagenzienaustauschs aufgrund der diffundierenden fluoreszierenden Antikörper im Translationmix ein universeller Anstieg des Fluoreszenzspiegels im Hintergrund (Abbildung 5B). Die Antikörperbindung an ein aufkeimendes Polypeptid führte zu einer sofortigen Erhöhung der Fluoreszenz, während die Entflechtung von Antikörper/Polypeptid von mRNA eine sofortige Fluoreszenzabnahme bewirkt (Abbildung 5B).

Die Verweilzeit der Antikörperbindung kann verwendet werden, um die gesamtdekodierungszeit eines offenen Leserahmens zu messen. Das Verweilzeit-Histogramm für LUCFLAG mRNA passt zu einer Log-Normalverteilung (Abbildung 6A) und ergab eine Peptidsyntheserate von 2,5 ± 0,1 Aminosäuren pro Sekunde15. Die erste Ankunftszeit Histogramm passt zu einer verschobenen (3-Parameter) log-normalen Funktion (Abbildung 6B). Die breite Verbreitung des ersten Ankunftszeit-Histogramms zeigt den hohen Grad an Heterogenität in einzelnen mRNA-Translationsaktivitäten. Das Histogramm deutete darauf hin, dass das erste Peptidsyntheseereignis an einzelnen LUCFLAG mRNA-Molekülen bereits nach 2 min und nach 20 min nach der Übersetzungsmix-Lieferung beginnen könnte (Abbildung 6B). Im Vergleich zur Übersetzung mit LUCFLAG mRNA zeigte das erste Ankunftszeit-Histogramm mit hp-LUCFLAG mRNA-Translation eine langsamere Antikörperbindung ( Abbildung7A). Die Verwendung von Massenlumineszenzmessungen aus zellfreien Translationsreaktionen mit denselben mRNAs löst jedoch keine Unterschiede in der Translationskinetik (Abbildung 7B,C). Diese Ergebnisse zeigen die höhere Auflösung unserer Methode im Vergleich zu massenkinetischen Luziferase-Aktivitätsmessungen zum Nachweis kleiner Veränderungen in der Initiationskinetik.

Figure 1
Abbildung 1: Protokollflussdiagramm. Schematische Darstellungen von Deckslip- und Diavorbereitung, Einzelmolekül-Kammermontage, TIRF-Bildgebung und Datenerfassung sowie Datenanalyseschritte werden dargestellt. Der TIRF-Bildgebungsschritt umfasst schematische Darstellungen von mRNA-Immobilisierung und -Translation in einem Strömungskanal. Nachweisoberflächenkomponenten, fluoreszierend markierte Antikörper und Zellextraktkomponenten sind angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: mRNA-Designs für den Einzelmolekül-Assay. (A) Um einen Massenübersetzungstest an den Einzelmolekül-Assay anzupassen, wurde die DNA-Vorlage des Massenreporters ORF mit einer N-Terminal-Epitop-Tag-Sequenz-Einfügung modifiziert, um einen mit Reportern kodierenden ORF zu generieren. ORF- und N-Terminal-Tag-Codierungsbereiche werden angezeigt. (B) mRNAs waren 5 m7G begrenzt, um eine kappenabhängige Translation zu ermöglichen, und 3-biotinyliert für ihre Immobilisierung zur Einzelmolekül-Detektionsoberfläche. 5'-m7G-Kappe und 3-Biotin sind auf nicht markierten und markierten ORF-RNAs angegeben. (C) Luciferase-kodierende mRNAs wurden verwendet, um den Einzelmolekül-Assay zu demonstrieren. LUC und LUCFLAG mRNAs kodieren Luziferase, die fehlt und enthält ein N-Terminal 3xFLAG-Tag, bzw. hp-LUCFLAG mRNA enthält eine zusätzliche Einfügung, die eine Haarnadel-Sekundärstruktur in die LUCFLAG mRNA 5-Leader einführt. Die Haarnadel-Thermostabilität, 3-Poly(A) Schwanz, und 3-Biotin sind angezeigt. Alle drei mRNAs enthielten einen 30 nt 3-Poly(A)-Schwanz für eine effizientere kappenabhängige Übersetzung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Einzelmolekül-Reporter mRNA-Integrität und Massenübersetzung. (A) Vertreter denaturieren PAGE-Bildgebung des Einzelmolekül-Reporters mRNA. 5'-m7G gekappt und 3'-biotinylierte LUCFLAG mRNA wurde auf ein denaturierendes 10% Polyacrylamid-Gel neben einer RNA-Leiter geladen. (B) Der Einzelmolekülreporter mRNA bewahrte die 5'-Cap-Abhängigkeit in massenzellfreien Translationsreaktionen. Die 3-biotinylatierte LUCFLAG mRNA, die entweder fehlte (-cap) oder enthielt (+ Kappe) eine 5-m7G Kappe wurde in S. cerevisiae Übersetzungsextrakt für 30 min bei 25 °C übersetzt. Die Luziferaseaktivität wurde von zwei unabhängigen Reaktionen gemessen und auf die Aktivität mit -cap mRNA normalisiert, die willkürlich auf 1,0 eingestellt ist. Standardabweichungen von Mittelwerten werden durch Fehlerbalken angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Abbildung von Nachweisflächen, die immobilisierte mRNA enthalten. (A) Hintergrundfluoreszenz ohne Übersetzungsmix. (B) Cy3-Leuchtstoffflecken in einem Sichtfeld 30 min nach der Übersetzungsmix-Lieferung und mit einem optimierten Laser-Einfallswinkel. (C) Bildfeld 30 min nach Übersetzungsmix-Lieferung und mit einem niedrigen Laser-Einfallswinkel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Bildanalyse. (A) Cy3-Spots in einem Sichtfeld ohne (linkes Panel) oder mit (rechtem Panel) Spotauswahl. (B) Beispiel für die einmolekulare Flugbahn eines ausgewählten Cy3-Spots. Der schwarze Pfeil zeigt den Anstieg der Hintergrundfluoreszenz aufgrund diffundierender Antikörper während der Übersetzungsmix-Lieferung an. Der grüne Pfeil zeigt den plötzlichen Anstieg der Fluoreszenzintensität durch Cy3-FLAG-Bindung an. Der rote Pfeil zeigt die plötzliche Abnahme der Fluoreszenzintensität durch Cy3-FLAG/nascent Peptiddissoziation von mRNA an. Die Verweilzeit eines Cy3-FLAG-Bindungsereignisses wird mit einem Doppelpfeil angegeben. Roh-, gefilterte und digitalisierte Daten werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Kinetische Analyse der Cy3-FLAG-Bindung mit LUCFLAG mRNA-Translation. (A) Das Cy3-FLAG-Bindungszeithistogramm passt zu einer Log-Normalverteilung. (B) Das Cy3-FLAG-Bindungs-Erstankunftszeit-Histogramm passt zu einer verschobenen (3-Parameter) Log-Normal-Funktion. Angepasst von Wang et al.15 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Der Einzelmolekül-Assay hat eine höhere Auflösung für die Initiationskinetik als der Bulk-Lumineszenz-Assay. (A) Erstankunftszeit Histogramme für Cy3-FLAG-Bindung mit Übersetzung von LUCFLAG und HP-LUCFLAG mRNAs ergaben eine langsamere Initiation, verursacht durch eine kleine Haarnadelstruktur in der mRNA 5-Leader. N = 10650 Flugbahnen (LUCFLAG), kombiniert aus 3 Datensätzen und N = 4079 Flugbahnen (HP-LUCFLAG), kombiniert aus 2 Datensätzen. (B,C) Massen-Luziferase-Aktivitäts-Etikum-Messungen lösten keine Unterschiede in der Initiationskinetik für LUCFLAG (N = 9 Datensätze) und hp-LUCFLAG (N = 6 Datensätze) mRNA-Übersetzung. (B) Bulk Lumineszenzkinetik. (C) Streudiagramme der Ersten Runde der Übersetzungszeiten, die durch Gaußsche Anpassung an die zweite Ableitung der Lumineszenz-Kinetikkurven in (B) bestimmt werden, wie von Vassilenko et al. beschrieben. 46. Die roten Kreise und Balken in (C) stellen den Mittelwert und die Standardabweichung der berechneten Übersetzungszeit der ersten Runde dar. Angepasst von Wang et al.15 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Im Vergleich zu typischen in vitro TIRF Einzelmolekülexperimenten ist die hier beschriebene Einzelmolekül-Bildgebung mit dem hier beschriebenen Assay durch den Einsatz von Zellextrakt und einer hohen Konzentration fluoreszierend markierter Antikörper zusätzlich komplex. Im Vergleich zur gebräuchlicheren Praxis einer Flächen-PEGylation reduziert eine zweite Runde PEGylation (Schritt 2) die unspezifische Antikörperbindung an die Nachweisfläche15erheblich. Die hohe Konzentration diffundierender fluoreszierender Antikörper verursacht einen extrem hochfluoreszierenden Hintergrund, der die Einzelmoleküldetektion der Antikörperbindung verschleiert. Um diesen fluoreszierenden Hintergrund zu reduzieren, wird der Lasereinfallswinkel deutlich über dem kritischen Winkel (Schritt 3.4.) erhöht. Die Antikörperdetektion wird auch durch übermäßige Fluorophor-Instabilität verringert, was die Fähigkeit zur Quantifizierung der Verweilzeit einschränken kann. Wenn Sie auf dieses Problem stoßen, ersetzen Sie das Fluorophor durch ein fototocherres Fluorophor, z. B. das, das zu einem Triplet-State-Quencher47konjugiert ist, oder senken Sie die Laserbeleuchtungsintensität. Obwohl Sauerstoff-Aufräumsysteme häufig in In-vitro-Einzelmolekülexperimenten zur Unterdrückung von Fluorophor-Photobleichungen48,49verwendet werden, kann der hier beschriebene Test ein sehr großzügiges Detektionsfenster bieten, ohne Sauerstoffsuchsysteme zu implementieren15. Darüber hinaus können Sauerstoff-Aufräumsysteme die eukaryotische zellfreie Übersetzungseffizienz erheblich reduzieren. Daher sollten Sauerstoff-Aufräumsysteme sorgfältig vor ihrer Verwendung mit diesem Test bewertet werden.

Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass kleine Variationen in der Reagenzpräparation durch den Test aufgrund seiner Einzelmolekülauflösung erkannt werden. Beispielsweise können Replizieren von Übersetzungsextraktpräparaten verschiedene Aktivitäten anzeigen, die mit Massenmethoden erkannt werden können oder nicht. Darüber hinaus können Gefrier-Tau-Zyklen von Translationsextrakten und anderen Reagenzien die Übersetzungsaktivität schnell beeinträchtigen. Wir empfehlen, kleine Pilotversuche mit leicht zugänglichem Material durchzuführen, um Bedingungen zu testen, bevor eine systematische Studie geplant wird. Für eine systematische Studie werden großangelegte Präparate von Translationsreagenzien, Einweg-Aliquots für gefrier-/tauempfindliche Reagenzien und Konsistenz bei der Durchführung von Protokollschritten empfohlen. Translation-Extrakt, der in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert wird, zeigt einen minimalen Aktivitätsverlust für mindestens zwei Jahre. Die Anwendung dieser Maßnahmen kann experimentelle Variationen effektiv unterdrücken und die Robustheit des Einzelmolekül-Assays erhöhen.

Da diese Methode bestehende massenzellfreie Übersetzungssysteme und in vitro einzelmolekulare Bildgebungstechniken kombiniert, wird die Problembehandlung generischer Probleme in diesen beiden Bereichen hier nicht diskutiert. Beispiele für solche generischen Probleme sind minderwertige Präparate von Reporter mRNA oder PEGylated Coverslip und geringe Translationsaktivität von Zellextrakt. Hier werden wir uns auf spezifische Themen für diese Methode konzentrieren. Zusätzlich zu den verschiedenen technischen Problemen, die im Protokoll erörtert wurden, kann ein weiteres potenzielles Problem gering oder keine Antikörperbindung im Strömungskanal für eine Übersetzungsbedingung sein, von der eine gute Aktivität erwartet wird. Es gibt mehrere Möglichkeiten zur Fehlerbehebung. Die Wirksamkeit der biotinylierten mRNA-Immobilisierung an der Nachweisoberfläche kann beurteilt werden, indem komplementäre und fluorophorkonjugierte DNA-Oligomere zur immobilisierten mRNA geglüht und die fluoreszierenden DNA:RNA-Duplexe geabbildungen. Die Qualität des Übersetzungsmixes und der biotinylierten Reporter-mRNAs kann durch ausführen des Massenübersetzungs-Assays überprüft werden. Darüber hinaus kann die Translationsreaktionslösung nach durchführung einer Translationsreaktion in einem mRNA-immobilisierten Strömungskanal aus dem Kanal pipettiert und in einem Reporteraktivitätstest verwendet werden, um das Auftreten von In-Channel-Translation zu bestätigen. Bei Bedarf kann eine zu hohe mRNA-Oberflächendichte für die in-Channel-Translationsreaktion verwendet werden, um eine einfachere Erkennung durch den Reporteraktivitätstest zu ermöglichen.

Die Hauptbeschränkung dieses Assays ist seine Auflösung für Initiationskinetik. In diesem Test enthält die direkte experimentelle Ausgabe, die erste Ankunftszeit, sowohl die Erstrunden-Initiationszeit als auch die Peptiddehnungszeit für die Übersetzung des Epitals und 35 zusätzliche Codons. Obwohl der Beitrag der Peptiddehnungszeit korrigiert werden kann (Schritt 6.9.), ist dieser Test daher am empfindlichsten für die Messung der Initiationskinetik, die in der Reihenfolge von Minuten auftritt, die eine generische Eigenschaft der kappenabhängigen Initiation15zu sein scheint. Experimentell ist es einfach, diesen Test anzupassen, um andere Initiationsmechanismen zu untersuchen. Wenn jedoch ein Initiationsmechanismus in der Größenordnung von Sekunden signifikant schnell auftritt, ist es unwahrscheinlich, dass dieser Test die Initiationskinetik auflöst.

Der hier beschriebene Einzelmolekül-Ansatz kombiniert einzelmolekulare Bildgebung und extraktbasierte Übersetzung, um Messungen einzelner kappenabhängiger Translationsereignisse in Echtzeit und bei aktiver zellfreier Übersetzung zu ermöglichen. Der Assay ermöglicht den einfachen Übergang von einem Massenübersetzungstest zu einem Einzelmolekül-Assay, während die Massenübersetzungskinetik erhalten bleibt. So können kinetische Einzelmolekülbeobachtungen in direktem Bezug zu entsprechenden Massenergebnissen interpretiert werden. Frühere Methoden, einschließlich der kürzlich entwickelten in vivo-Ansätze 11,12,13,14, fehlen die Auflösung für kinetische Messungen einzelner Translationsinitiationsereignisse und erfordern Annahmen von Translationsmechanismen, um Initiationszeitdurchschnitte aus experimentellen Beobachtungen zu extrahieren. Die hier vorgestellte Einzelmolekülmethode bietet den ersten hypothesenfreien Ansatz zur Quantifizierung der durchschnittlichen Initiationszeit aktiver kappenabhängiger Übersetzungen. Obwohl massenkinetische Messungen mit einem Lumineszenz-Assay verwendet wurden, um die quantitativsten und systematischsten Massencharakterisierungen der kappenabhängigen Translationskinetik bis heute46,50zu liefern, misst der hier beschriebene Einzelmolekül-Assay durchschnittliche initiöse kinetische Veränderungen mit größerer Empfindlichkeit als der Bulk-Assay (Abbildung 7). Darüber hinaus bewahren die Einzelmoleküldaten einzelne mRNA-Translationsstocostizität und Heterogenität, Eigenschaften, die in Massenmessungen gemittelt werden. Die Einzelmolekülauflösung der Translationskinetik kann für systematische kinetische Analysen genutzt werden, um Erkenntnisse über Übersetzungsmechanismen zu gewinnen, die mit anderen Methoden nicht erreichbar sind.

Dieser Test ist kompatibel mit bestehenden biochemischen und genetischen Ansätzen, die häufig für Übersetzungsstudien verwendet werden. Beispielsweise kann die translationale Funktion eines bestimmten Faktors untersucht werden, indem ein faktorreicher Extrakt erzeugt und durch einen Wildtyp- oder Mutantenfaktor ergänzt wird. Darüber hinaus können Studien durch die Ergänzung des fluoreszierend markierten Faktors potenziell die kinetische Beziehung zwischen Faktorbindung und dem Verlauf der Übersetzung untersuchen. Mit der Verwendung von zwei unterschiedlichen Epitop-/Antikörperpaaren könnte dieses Protokoll potenziell von einem einfarbigen Assay zu einem zweifarbigen Assay erweitert werden, der die gleichzeitige Erkennung von zwei unterschiedlichen Codierungssequenzen ermöglicht. Diese Anpassung würde die Nachverfolgung der Übersetzung verschiedener Leserahmen ermöglichen und könnte auf Frameshifting angewendet werden und Standortauswahlstudien starten. Alternativ könnte ein zweifarbiges System verwendet werden, um Antikörper-Wechselwirkungen mit markierten Polypeptiden zu erkennen, die von vor- und nachgelagerten offenen Leserahmen kodiert werden, um sowohl vor- als auch nachgelagerte Translationsereignisse auf einzelnen mRNAs zu überwachen. Diese Erweiterungen können eine breite Palette von mechanistischen Studien ermöglichen, die die kappenabhängige Übersetzung und ihre Regulierung untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [R01GM121847] unterstützt; das Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); und msKCC Functional Genomics Initiative.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X oil objective, N.A. 1.49 Olympus UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1) Bio-Rad 161-0144
Alkaline liquid detergent Decon 5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCT Specialties, LLC A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD Andor DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software Andor For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter Chroma 532/640/25
Band-pass filter Chroma NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio Inc Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid Prolume 309-250
Coolterm software For controlling the syringe pump
Desktop computer Dell For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror Semrock R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX Fisher Scientific NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Epoxy Devcon 14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid Prolume 306-250
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP1185500
Hydrogen perioxide Sigma-Aldrich 216763-500ML
Immersion oil Olympus Z-81226A Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System Promega E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit Thermo fisher AM1334
Methanol Fisher Scientific MMX04751
Microscope Olympus IX83
Microscope slide Thermo Scientific 3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 Sigma-Aldrich A9594
mPEG-SVA Laysan Bio Inc mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4 Thermo Scientific 22341
NaCl (5M) Thermo Scientific AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass Fisherband 12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM Olympus digital Laser system CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software Olympus For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table TMC vibration control 63-563 With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix Sigma-Aldrich 77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit Thermo Scientific 20160
Potassium hydroxide pellets Sigma-Aldrich P1767-500G
Prior motorized XY translation stage Prior PS3J100
Prior PriorTest software Prior For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor Promega N2515
Stage top Incubator In vivo scientific (world precision Instruments) 98710-1 With a custom built acrylic cage
Staining jar Fisher Scientific 08-817
Streptavidin Thermo Scientific 43-4301
Sulfuric acid Fisher Scientific A300212
SYBR green II Fisher Scientific S7564
Syringe Hamilton 1725RN
Syringe pump Harvard apparatus 55-3333
Tris (1M), pH = 7.0 Thermo Scientific AM9850G
Ultrasonic Bath Branson CPX1800H
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Vaccinia Capping system New England Biolabs M2080S
Zymo-Spin IC Columns Zymo Research C1004

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Biochemie Ausgabe 163 zellfreie eukaryotische Translation Single-Molekül Translation Skinetik In-vitro-Fluoreszenz-Bildgebung capabhängige Initiierung translationale Kontrolle In-vitro-Assay
Ein <em>In Vitro</em> Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics
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Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics. J. Vis. Exp. (163), e61648, doi:10.3791/61648 (2020).

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