Sporing af individuelle oversættelseshændelser giver mulighed for kinetiske undersøgelser i høj opløsning af cap-afhængige oversættelsesmekanismer. Her demonstrerer vi en in vitro enkeltmolekyleanalyse baseret på billeddiagnostiske interaktioner mellem fluorescerende mærkede antistoffer og epitop-mærkede spirende peptider. Denne metode muliggør enkeltmolekylekarakterisering af initiering og peptidforlængelse kinetik under aktiv in vitro cap-afhængig oversættelse.
Cap-afhængig proteinsyntese er den fremherskende oversættelsesvej i eukaryote celler. Mens forskellige biokemiske og genetiske tilgange har tilladt omfattende undersøgelser af cap-afhængig oversættelse og dens regulering, mangler der stadig kinetisk karakterisering af denne oversættelsesvej i høj opløsning. For nylig udviklede vi en in vitro-analyse til måling af cap-afhængige oversættelse kinetik med enkelt-molekyle opløsning. Analysen er baseret på fluorescerende mærket antistofbinding til spirende epitop-mærket polypeptid. Ved at beskringe bindingen og dissociationen af antistoffer til og fra spirende peptid-ribosome-mRNA-komplekser kan oversættelsesprogressionen på individuelle mRNA’er spores. Her præsenterer vi en protokol til etablering af denne analyse, herunder mRNA og PEGylated slide præparater, real-time billeddannelse af oversættelse, og analyse af enkelt molekyle baner. Denne analyse gør det muligt at spore individuelle cap-afhængige oversættelse begivenheder og løser centrale oversættelse kinetik, såsom indledning og forlængelse satser. Analysen kan i vid udstrækning anvendes på særskilte oversættelsessystemer og bør i det store og hele være til gavn for in vitro-undersøgelser af cap-afhængige oversættelseskinetik og translationelle kontrolmekanismer.
Oversættelse i eukaryote systemer sker overvejende gennem 7-methylguanosin (m7G) hætteafhængige veje1. Undersøgelser viser , at indledningen af eukaryote oversættelse er hastighedsbegrænsende og et fælles mål for regel2,3,4. Mekanismer til cap-afhængig oversættelse er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af genetiske5, biokemiske6,7,8, strukturelle9og genomiske10 bulk tilgange. Selv om disse metoder har identificeret forskellige mekanismer, der regulerer cap-afhængige indledning, deres opløsning begrænser dem til ensemble gennemsnit af signaler fra heterogene og asynkrone indledning begivenheder. På det seneste er individuelle in vivo-oversættelseshændelser blevet visualiseret ved hjælp af metoder , der måler fluorescerende antistofbinding til epitoper på spirende polypeptider11,12,13,14. Men disse nye tilgange er også begrænset i deres evne til at løse individuelle indledning begivenheder, fordi flere fluorescerende antistoffer skal binde en spirende peptid at tillade enkelt oversættelse begivenheder, der skal løses fra en høj intracellulær fluorescens baggrund. I mange biologiske interaktioner har løst individuelle kinetiske hændelser givet kritisk indsigt i forståelse af komplekse multistep og gentagne biologiske processer, der ikke er mulige at synkronisere på molekylært niveau. Der er behov for nye metoder, der kan spore dynamikken i de enkelte oversættelseshændelser, for at få en bedre forståelse af cap-afhængig indledning og regulering.
Vi har for nylig udviklet en in vitro-analyse, der måler cap-afhængige indledning kinetik med enkelt-molekyle opløsning15. I betragtning af det store antal kendte og ukendte proteinfaktorer, der er involveret i denne indledningsvej3,16, blev enkeltmolekyleanalysen udviklet til at være kompatibel med eksisterende in vitro-cellefri oversættelsessystemer for at drage fordel af deres bevarelse af cellulære faktorer og robust oversættelsesaktivitet17,18,19,20,21,22,23,24,25. Desuden giver brugen af cellefrie oversættelsessystemer mulighed for mere kompatible sammenligninger mellem observationer med et enkelt molekyle og tidligere bulkresultater. Denne tilgang giver en ligetil integration af nye enkelt-molekyle kinetisk indsigt i de eksisterende mekanistiske rammer for cap-afhængige indledning. For at etablere enkeltmolekyleanalysen ændres det traditionelle cellefrie oversættelsessystem på tre måder: en epitopkodningssekvens indsættes i begyndelsen af en reporter mRNA’s åbne læseramme (ORF); den 3 ‘ende af reporter mRNA er biotinyleret til at lette mRNA ende-tøjring til enkelt-molekyle detektion overflade; og fluorescerende mærkede antistoffer suppleres med oversættelsesekstraktet. Disse modifikationer kræver kun grundlæggende molekylærbiologiske teknikker og almindeligt tilgængelige reagenser. Desuden bevarer disse modifikationer og enkeltmolekylebilleddannelsesbetingelserne oversættelseskinetik af massecellefrie oversættelsesreaktioner15.
I denne analyse (Figur 1), 5′-end udjævnet og 3′-end biotinyleret reporter mRNA er immobiliseret til en streptavidin-belagt detektion overflade i et flow kammer. Flowkammeret fyldes derefter med en cellefri oversættelsesblanding suppleret med fluorescerende mærkede antistoffer. Efter at mRNA-oversættelsen har fundet sted for ca. 30-40 codoner neden for epitopsekvensen26,27, kommer epitopen ud af ribosomets udgangstunnel og bliver tilgængelig for at interagere med fluorescerende mærket antistof. Denne interaktion er hurtig, og dens detektion ved hjælp af fluorescensbilledteknikker med et enkelt molekyle gør det muligt at spore oversættelseskinetik med enkeltmolekyleopløsning under aktiv cellefri oversættelse. Denne analyse bør i det store og hele være til gavn for in vitro-undersøgelser af cap-dependent translation kinetik og dens regulering, især for systemer med en fungerende bulk in vitro-analyse.
En forudsætning for at etablere denne enkeltmolekyleanalyse er en fungerende massecellefri oversættelsesanalyse, som kan opnås ved hjælp af oversættelsesekstrakt, der enten er kommercielt tilgængeligt eller tilberedt efter tidligere beskrevne metoder28. Eukaryote oversættelsesekstrakt kan fås fra forskellige celler, herunder svampe, pattedyr og plante28. Til billeddannelse kræver denne analyse et TIRF-mikroskop udstyret med justerbar laserintensitet og hændelsesvinkel, et motoriseret prøvestadie, et motoriseret fluidics-system og prøvetemperaturstyringsenhed. Sådanne krav er generiske for moderne in vitro enkeltmolekyle TIRF eksperimenter og kan opnås anderledes. Eksperimentet præsenteret her bruger en objektiv-type TIRF system, der består af kommercielt tilgængelige mikroskop, software og tilbehør alle opført i tabellen over materialer.
I sammenligning med typiske in vitro TIRF enkeltmolekyle eksperimenter, enkelt-molekyle billeddannelse med analysen beskrevet her er desuden kompliceret på grund af brugen af celleekstrakt og en høj koncentration af fluorescerende mærket antistof. Sammenlignet med den mere almindelige praksis med en runde af overflade PEGylation reducerer en anden runde pegylation (trin 2) i høj grad uspecifik antistofbinding til detektionsoverflade15. Den høje koncentration af diffuserende fluoresce…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [R01GM121847]; Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant / Core Grant (P30 CA008748); og MSKCC Functional Genomics Initiative.
100X oil objective, N.A. 1.49 | Olympus | UAPON 100XOTIRF | |
Acryamide/bis (40%, 19:1) | Bio-Rad | 161-0144 | |
Alkaline liquid detergent | Decon | 5332 | |
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) | UCT Specialties, LLC | A0700 | |
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD | Andor | DU-897U-CSO-#BV | |
Andor Solis software | Andor | For controlling the Andor EMCCD | |
Band-pass filter | Chroma | 532/640/25 | |
Band-pass filter | Chroma | NF03-405/488/532/635E-25 | |
Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio Inc | Biotin-PEG-SVA | |
Coenzyme A free acid | Prolume | 309-250 | |
Coolterm software | For controlling the syringe pump | ||
Desktop computer | Dell | For controlling the microscope, camera, stage, and pump. | |
Dichroic mirror | Semrock | R405/488/532/635 | |
Direct-zol RNA microprep 50RNX | Fisher Scientific | NC1139450 | |
Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
Epoxy | Devcon | 14250 | |
Firefly luciferin D-Luciferin free acid | Prolume | 306-250 | |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP1185500 | |
Hydrogen perioxide | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | |
Immersion oil | Olympus | Z-81226A | Low auto-fluorescence |
Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit | Thermo fisher | AM1334 | |
Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
Microscope | Olympus | IX83 | |
Microscope slide | Thermo Scientific | 3048 | |
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 | Sigma-Aldrich | A9594 | |
mPEG-SVA | Laysan Bio Inc | mPEG-SVA-5000 | |
MS(PEG)4 | Thermo Scientific | 22341 | |
NaCl (5M) | Thermo Scientific | AM9760G | |
No 1.5 microscope Cover glass | Fisherband | 12-544-C | |
Olympus Laser, 532nm 100mM | Olympus digital Laser system | CMR-LAS 532nm 100mW | |
Olympus TirfCtrl software | Olympus | For controlling the laser intensity and incident angle | |
Optical table | TMC vibration control | 63-563 | With vibration isolation |
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix | Sigma-Aldrich | 77617-100ml | |
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit | Thermo Scientific | 20160 | |
Potassium hydroxide pellets | Sigma-Aldrich | P1767-500G | |
Prior motorized XY translation stage | Prior | PS3J100 | |
Prior PriorTest software | Prior | For controlling the Prior motorized stage | |
Recombinant RNasin RNase Inhibitor | Promega | N2515 | |
Stage top Incubator | In vivo scientific (world precision Instruments) | 98710-1 | With a custom built acrylic cage |
Staining jar | Fisher Scientific | 08-817 | |
Streptavidin | Thermo Scientific | 43-4301 | |
Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300212 | |
SYBR green II | Fisher Scientific | S7564 | |
Syringe | Hamilton | 1725RN | |
Syringe pump | Harvard apparatus | 55-3333 | |
Tris (1M), pH = 7.0 | Thermo Scientific | AM9850G | |
Ultrasonic Bath | Branson | CPX1800H | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
Vaccinia Capping system | New England Biolabs | M2080S | |
Zymo-Spin IC Columns | Zymo Research | C1004 |