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Biochemistry

कैप-डिपेंडेंट ट्रांसल काइनेटिक्स के विश्लेषण के लिए इन विट्रो सिंगल-अणु इमेजिंग परख

Published: September 15, 2020 doi: 10.3791/61648
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

व्यक्तिगत अनुवाद घटनाओं पर नज़र रखने कैप-निर्भर अनुवाद तंत्र के उच्च संकल्प गतिज अध्ययन के लिए अनुमति देता है। यहां हम फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी और एपिटोप-टैग नवजात पेप्टाइड्स के बीच इमेजिंग इंटरैक्शन के आधार पर एक इन विट्रो एकल-अणु परख प्रदर्शित करते हैं। यह विधि सक्रिय इन विट्रो कैप-डिपेंडल अनुवाद के दौरान दीक्षा और पेप्टाइड विस्तार गतिज के एकल अणु लक्षण वर्णन को सक्षम बनाती है।

Abstract

कैप-डिपेंडेंट प्रोटीन संश्लेषण यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रमुख अनुवाद मार्ग है। जबकि विभिन्न जैव रासायनिक और आनुवंशिक दृष्टिकोणों ने कैप-निर्भर अनुवाद और इसके विनियमन के व्यापक अध्ययन की अनुमति दी है, इस अनुवाद मार्ग के उच्च संकल्प गतिज लक्षण वर्णन अभी भी कमी है। हाल ही में, हमने एकल-अणु संकल्प के साथ कैप-निर्भर अनुवाद काइनेटिक्स को मापने के लिए एक इन विट्रो परख विकसित की। परख फ्लोरोसेंटी लेबल एंटीबॉडी पर आधारित है जो नवजात एपिटोप-टैग किए गए पॉलीपेप्टाइड के लिए बाध्यकारी है। नवजात पेप्टाइड-राइबोसोम-एमआरएनए परिसरों से एंटीबॉडी के बाध्यकारी और वियोजन को इमेजिंग करके, व्यक्तिगत mRNAs पर अनुवाद प्रगति को ट्रैक किया जा सकता है। यहां, हम इस परख को स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसमें एमआरएनए और पेग्यालेटेड स्लाइड तैयारी, अनुवाद की वास्तविक समय इमेजिंग और एकल अणु प्रक्षेप पथ का विश्लेषण शामिल है। यह परख व्यक्तिगत टोपी पर निर्भर अनुवाद घटनाओं की ट्रैकिंग में सक्षम बनाता है और इस तरह के दीक्षा और विस्तार दरों के रूप में प्रमुख अनुवाद काइनेटिक्स, हल करता है । परख व्यापक रूप से अलग अनुवाद प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकता है और मोटे तौर पर टोपी पर निर्भर अनुवाद गतिज और अनुवाद नियंत्रण तंत्र के विट्रो अध्ययन में लाभ होना चाहिए ।

Introduction

यूकेरियोटिक सिस्टम में अनुवाद मुख्य रूप से 7-मिथाइलगुआनोसिन (एम 7 जी) कैप-निर्भररास्ते1के माध्यम से होता है। अध्ययनों से पता चलता है कि यूकेरियोटिक अनुवाद का दीक्षा कदम दर-सीमित हैऔर विनियमन2,3,4के लिए एक आम लक्ष्य है। कैप-निर्भर अनुवाद के तंत्र का आनुवंशिक5,जैव रासायनिक6,7,8,संरचनात्मक9,और जीनोमिक10 थोक दृष्टिकोणों का उपयोग करके बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। यद्यपि इन तरीकों ने विविध तंत्रों की पहचान की है जो कैप-निर्भर दीक्षा को विनियमित करते हैं, उनका संकल्प उन्हें विषम और अतुलित दीक्षा घटनाओं से संकेतों के औसत के कलाकारों की टुकड़ी तक सीमित करता है। हाल ही में, वीवो अनुवाद घटनाओं में व्यक्तिगत तरीकों से कल्पना की गई है जो फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी को नवजात पॉलीपेप्टिड्स11, 12,13,14पर एपिटोप करने के लिए बाध्यकारी उपाय करते हैं। हालांकि, ये नए दृष्टिकोण व्यक्तिगत दीक्षा घटनाओं को हल करने की क्षमता में भी सीमित हैं क्योंकि कई फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी को एक प्रारंभिक पेप्टाइड को बांधना चाहिए ताकि एकल अनुवाद घटनाओं को उच्च इंट्रासेलुलर फ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि से हल किया जा सके। कई जैविक बातचीत में, हल किए गए व्यक्तिगत गतिज घटनाओं ने जटिल मल्टीस्टेप और दोहराव वाली जैविक प्रक्रियाओं को समझने में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है जो आणविक स्तर पर सिंक्रोनाइज़ करना संभव नहीं है। नए तरीके जो व्यक्तिगत अनुवाद घटनाओं की गतिशीलता को ट्रैक कर सकते हैं, कैप-निर्भर दीक्षा और विनियमन की बेहतर समझ के लिए आवश्यक हैं।

हमने हाल ही में एक इन विट्रो परख विकसित की है जो एकल-अणु संकल्प15के साथ कैप-निर्भर दीक्षा काइनेटिक्स को मापता है। इस दीक्षा मार्ग 3,16में शामिल ज्ञात और अज्ञात प्रोटीन कारकों की बड़ी संख्या को ध्यान में रखतेहुए,एकल अणु परख को मौजूदा इन विट्रो सेल-मुक्त अनुवाद प्रणालियों के साथ संगत करने के लिए विकसित किया गया था ताकि सेलुलरकारकों के संरक्षण और मजबूत अनुवाद गतिविधि17, 18,19,20, 21,22, 23,24,25के संरक्षण से लाभ हो सके । इसके अलावा, सेल-मुक्त अनुवाद प्रणालियों का उपयोग एकल-अणु टिप्पणियों और पिछले थोक परिणामों के बीच अधिक संगत तुलना की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण कैप-निर्भर दीक्षा के मौजूदा यंत्रवादी ढांचे में नए एकल-अणु गतिज अंतर्दृष्टि का सीधा-आगे एकीकरण प्रदान करता है। एकल अणु परख स्थापित करने के लिए, पारंपरिक सेल-मुक्त अनुवाद प्रणाली को तीन तरीकों से संशोधित किया जाता है: एक रिपोर्टर एमआरएनए के खुले रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) की शुरुआत में एक एपिटोप-एन्कोडिंग अनुक्रम डाला जाता है; रिपोर्टर एमआरएनए का 3 'अंत एकल-अणु का पता लगाने की सतह पर एमआरएनए एंड-टेदरिंग की सुविधा के लिए बायोटिनिलेटेड है; और फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले एंटीबॉडी को अनुवाद निकालने के लिए पूरक किया जाता है। इन संशोधनों के लिए केवल बुनियादी आणविक जीव विज्ञान तकनीकों और आमतौर पर उपलब्ध अभिकर्षकों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, ये संशोधन और एकल-अणु इमेजिंग स्थितियां थोक सेल-मुक्त अनुवाद प्रतिक्रियाओं15के अनुवाद काइनेटिक्स को संरक्षित करती हैं।

इस परख में(चित्रा 1),5'-अंत छाया हुआ और 3'-अंत बायोटिनेलेटेड रिपोर्टर एमआरएनए को प्रवाह कक्ष में एक स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित डिटेक्शन सतह पर स्थिर किया जाता है। प्रवाह कक्ष तो फ्लोरोसेंटी लेबल एंटीबॉडी के साथ पूरक एक सेल मुक्त अनुवाद मिश्रण से भर जाता है । एमआरएनए अनुवाद के बाद एपिटोप अनुक्रम26, 27के लगभग 30-40 कोडन डाउनस्ट्रीम के लिए हुआहै,एपिटोप राइबोसोम निकास सुरंग से उभरता है और फ्लोरोसेंटली-लेबल एंटीबॉडी के साथ बातचीत करने के लिए सुलभ हो जाता है। यह बातचीत तेजी से होती है और एकल-अणु फ्लोरेसेंस इमेजिंग तकनीकों द्वारा इसका पता लगाने से सक्रिय सेल-मुक्त अनुवाद के दौरान एकल-अणु संकल्प के साथ अनुवाद काइनेटिक्स की ट्रैकिंग में सक्षम होता है। इस परख मोटे तौर पर टोपी पर निर्भर अनुवाद गतिज और उसके विनियमन के विट्रो अध्ययन में लाभ होना चाहिए, विशेष रूप से विट्रो परख में एक काम थोक के साथ प्रणालियों के लिए ।

इस एकल अणु परख की स्थापना के लिए एक शर्त एक काम थोक सेल मुक्त अनुवाद परख है, जो अनुवाद निकालने का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है कि या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है या पहले वर्णित तरीकों के बाद तैयार28। यूकेरियोटिक अनुवाद अर्क को विभिन्न कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें फंगल, स्तनधारी और पौधे28शामिल हैं। इमेजिंग के लिए, इस परख के लिए एक TIRF माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है जो ट्यूनेबल लेजर तीव्रता और घटना कोण, एक मोटराइज्ड नमूना चरण, एक मोटराइज्ड फ्लूइडिक्स सिस्टम और नमूना तापमान नियंत्रण उपकरण से लैस है। ऐसी आवश्यकताएं आधुनिक इन विट्रो एकल-अणु टीआईआरएफ प्रयोगों के लिए सामान्य हैं और इन्हें अलग ढंग से हासिल किया जा सकता है । यहां प्रस्तुत प्रयोग एक उद्देश्य प्रकार TIRF प्रणाली का उपयोग करता है जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोप, सॉफ्टवेयर और सहायक उपकरणों से बना है जो सभी सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध है ।

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Protocol

1. रिपोर्टर एमआरएनए की पीढ़ी

  1. एक डीएनए ट्रांसक्रिप्शन टेम्पलेट को संशोधित करें जो एक "टैग" रिपोर्टर एमआरएनए(चित्रा 2 ए)के लिए डीएनए ट्रांसक्रिप्शन टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए एन-टर्मिनस एपिटोप टैग-एन्कोडिंग अनुक्रम डालने के द्वारा एक थोक-परख "अनटैग" रिपोर्टर एमआरएनए को एनकोड करता है।
    नोट: इसकी बेहतर संवेदनशीलता और छोटी 3xFLAG टैग लंबाई के कारण इस परख के लिए 3xFLAG/एंटी-फ्लैग इंटरैक्शन की सिफारिश की जाती है । हालांकि, परख अन्य एपिटोप/एंटीबॉडी जोड़े के साथ संगत है ।
  2. रैखिक डीएनए टेम्पलेट्स और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट (सामग्रियों की तालिकादेखें) का उपयोग करके बिना टेप किए गए और टैग किए गए आरएनए को सिंथेसाइज करें। आमतौर पर, इन विट्रो लिखित आरएनए का 10-20 पीएमओएल बाद में आरएनए प्रसंस्करण के लिए पर्याप्त है ताकि एक व्यवस्थित एकल-अणु अध्ययन की अनुमति दी जा सके।
  3. निर्माता की सिफारिश के बाद एक एम 7 जी कैपिंग किट (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ आरएनए5' अंत(चित्रा 2B)को कैप करें।
  4. किट के साथ प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार बायोटिनिलेशन किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके आरएनए 3 'एंड(चित्रा 2 बी)को बायोटिनीलेट करें। फिनॉल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा आरएनए को शुद्ध करें और इसके बाद स्पिन कॉलम के साथ शुद्धि। 10-20 में एल्यूट आरएनए-आरएनएसई-मुक्त पानी। अनकैप्ड इनपुट आरएनए का लगभग 40-50% बरामद किया गया है।
  5. पहले29वर्णित एक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और आरएनए धुंधला द्वारा आरएनए अखंडता और एकाग्रता का आकलन करें ।
  6. इस बात की पुष्टि करने के लिए कि संशोधित एमआरएनए अनुवाद गुणों को बरकरार रखता है, इसकी पुष्टि करने के लिए 3'-एंड-बायोटिनेलेटेड टैग किए गए रिपोर्टर एमआरएनए के साथ थोक सेल-मुक्त अनुवाद30 करें। एक उदाहरण के रूप में, कैप-निर्भर अनुवाद को मापने और अनकैप्ड और छाया हुआ रिपोर्टर mRNAs के साथ थोक सेल मुक्त अनुवाद प्रतिक्रियाओं में रिपोर्टर गतिविधियों की तुलना करके पुष्टि की जा सकती है (प्रतिनिधि परिणामदेखें) ।

2. फ्लो चैंबर की तैयारी

  1. माइक्रोस्कोप उद्देश्य युक्ति शीट द्वारा निर्दिष्ट के रूप में, एक उपयुक्त कवरलिप मोटाई का चयन करें। उद्देश्य के लिए एक ग्लास या क्वार्ट्ज स्लाइड का चयन करें- या चश्मे-प्रकार कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) इमेजिंग सिस्टम31,क्रमशः।
  2. निम्नलिखित संशोधनों के साथ चंद्रडोस एट अल32 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के बाद कवरस्लिप और स्लाइड की सफाई, सलाइनीकरण, पेगिलेशन और चैंबर असेंबली करें।
    1. सोनीशन के साथ 20 मिनट के लिए 10% क्षारीय तरल डिटर्जेंट (v/v) में ड्रिल किए गए छेद युक्त स्लाइड धोएं। शेष सभी सफाई चरणों के लिए स्लाइड और कवर्लिप्स को मिलाएं।
    2. एसीटोन वॉश स्टेप को छोड़ दें। पिरान्हा नक़्क़ाशी समय 20 मिनट से 1 घंटे तक इनक्यूबेशन बढ़ाएं। 3 घंटे के लिए पहले दौर के PEGylation इनक्यूबेट । 3 घंटे के लिए एमएस (खूंटी)4 के साथ दूसरे दौर के पेगिलेशन को इनक्यूबेट करें ।

3. उपकरण तैयार करना

  1. एकल-अणु प्रयोग करने से पहले कम से कम 3 घंटे, माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर चालू करें और प्रयोगों की अत्यधिक ध्वनिक अशांति से बचने के लिए एयरफ्लो को कम दर पर कम करें। सेल-मुक्त अनुवाद प्रणाली के लिए इष्टतम तापमान के लिए इनक्यूबेटर तापमान सेट करें।
    नोट: अनुवाद तापमान के प्रति बेहद संवेदनशील है। इष्टतम प्रतिक्रिया तापमान प्रत्येक सेल निकालने प्रणाली के लिए विशिष्ट है। प्रतिक्रिया तापमान लक्षण वर्णन एक थोक सेल मुक्त अनुवाद प्रणाली के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम है। यह एकल अणु परख इसी थोक अनुवाद स्थिति के रूप में एक ही इष्टतम तापमान के तहत आयोजित किया जाना चाहिए ।
  2. एक एकल अणु प्रयोग करने से पहले कम से कम 1 घंटे लेजर बॉक्स के पीछे लेजर पावर बटन दबाकर लेजर चालू करें, लेजर सुरक्षा कुंजी को चालू करें, और स्टार्ट बटन दबाएं; माइक्रोस्कोप चालू करें और इमेजिंग मोड, ऑब्जेक्टिव और फिल्टर सेट का चयन करने के लिए टच स्क्रीन कंट्रोल पैनल पर टैप करें।
  3. EMCCD कैमरा, पूर्व चरण नियंत्रक, और सिरिंज पंप पर उनके शक्ति बटन दबाकर चालू करें। कंप्यूटर चालू करें और सॉफ्टवेयर एंडोर सोलिस (सॉफ्टवेयर 1) को नियंत्रित करने के लिए ईएमसीसीडी कैमरा, एआरएफसीआरएल (सॉफ्टवेयर 2) को नियंत्रित करने के लिए लेजर, प्रीटेस्ट (सॉफ्टवेयर 3) को नियंत्रित करने के लिए मोटरचालित चरण को नियंत्रित करने के लिए, और सिरिंज पंप को नियंत्रित करने के लिए कूलटर्म। डेटा अधिग्रहण शुरू होने से पहले कैमरे को अपने नामित कामकाजी तापमान को ठंडा और स्थिर करने की अनुमति दें।
  4. सॉफ्टवेयर 2 में, पुष्टि करें कि सही पैरामीटर लेजर तरंगदैर्ध्य, उद्देश्य प्रकार और कांच और नमूने के अपवर्तक सूचकांक के लिए निर्धारित किए गए हैं। कनेक्ट बटन पर क्लिक करें। लेजर तीव्रता सेट करने के लिए, लेजर तरंगदैर्ध्य के बगल में नियंत्रण बटन पर क्लिक करें, फिर लेजर नियंत्रण पॉप अप विंडो में, तीव्रता स्लाइड बार खींचें। फाइबर स्थिति स्लाइड बार खींचने या इसी प्रवेश गहराई इनपुट द्वारा वांछित कोण के लिए लेजर सेट करें। इमेजिंग न होने पर ऑफ मोड में लेजर बनाए रखने के लिए शटर बॉक्स की जांच सुनिश्चित करें।
    नोट: शटर बॉक्स की जांच करके लेजर शटर को खोलें और बंद करें। जब शुरू में परख की स्थापना, अलग लेजर तीव्रता और घटना कोण इष्टतम एकल अणु का पता लगाने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए । इष्टतम लेजर तीव्रता उज्ज्वल एकल अणु फ्लोरेसेंस और फ्लोरोफोरस के तेजी से फोटोब्लैचिंग को संतुलित करती है। घटना कोण महत्वपूर्ण कोण से परे बढ़ाया जाना चाहिए डिफ्यूजिंग लेबल एंटीबॉडी से उच्च फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को कम करने के लिए जब तक mRNA बाध्य एंटीबॉडी स्पष्ट रूप से हल कर रहे हैं । एक संदर्भ के रूप में, एक 532 एनएम लेजर को 2-7 रंग प्रति एंटीबॉडी के लेबलिंग अनुपात के साथ Cy3-लेबल एंटी-फ्लैग का उपयोग करके एक अध्ययन15 में 71.5 डिग्री तक सेट किए गए लेजर घटना कोण के साथ उद्देश्य पर 10 माइक्रोनडब्ल्यू के लिए सेट किया गया था।
  5. सॉफ्टवेयर 1 में, अधिग्रहण मोडके तहत गतिज चुनें, एक्सपोजर समय के लिए मापदंडों को इनपुट करें, गतिज श्रृंखला की लंबाई और ईएम लाभ मूल्य। निर्देशिका चुनें और डेटा इमेज फ़ाइल को सहेजने के लिए फाइल नाम असाइन करें।
  6. बाद में ट्यूबिंग धोने के कदम के लिए एक मामूली से तेज प्रवाह दर के लिए सिरिंज पंप सेट करें।
    एक माइक्रोफुज ट्यूब में 70% इथेनॉल का एक एलिकोट, सिरिंज पंप ट्यूबिंग को इथेनॉल समाधान में डालें, और ट्यूबिंग को धोने के लिए तीन बार हटाने और मोड बांटने के बीच सिरिंज पंप को टॉगल करने के लिए कूलटर्म का उपयोग करें। RNase मुक्त पानी का उपयोग कर दोहराएं।
    नोट: ट्यूबिंग लंबाई काफी लंबी होनी चाहिए ताकि अनुवाद मिश्रण को चरण 5 पर तिरस्कृत किया जा सके, केवल टयूबिंग से संपर्क करें, सिरिंज नहीं। यहां कुल्ला मात्रा तिरस्कृत अनुवाद मिश्रण की मात्रा से अधिक होना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि चरण 5 पर अनुवाद मिश्रण स्वच्छ ट्यूबिंग के संपर्क में रहता है।
  7. अंतिम पानी कुल्ला तिरस्कृत किया गया है के बाद, एक साफ ऊतक पोंछ पर ट्यूबिंग अंत dabbing द्वारा ट्यूबिंग के अंदर से अवशिष्ट पानी हटा दें । ट्यूबिंग एंड को एक साफ माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थापित करके सूखा बनाए रखें।

4. 3'-एंड बायोटिनेलेटेड एमआरएनए का इम्मोबिलाइजेशन

  1. उनके उपयोग से ठीक पहले तक सूखी बर्फ पर जमे हुए सेल निकालने और अनुवाद मिश्रण बनाए रखें। शेष जमे हुए अभिकर्णों को पिघलाएं और उन्हें बर्फ पर बनाए रखें।
  2. प्रवाह कक्ष को माइक्रोस्कोप नमूना धारक में रखें जिसमें कवरस्लिप साइड नीचे की ओर है और इसे टेप के साथ जगह में सुरक्षित करें। उपयोग में नहीं हैं कि प्रवाह चैनलों के इनलेट्स और आउटलेट को कवर करने के लिए टेप का उपयोग करें।
  3. पिपेट एक 1.5x वॉल्यूम (चैनल वॉल्यूम के सापेक्ष; 0.2 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टाविडिन के स्टेप 4 और स्टेप 5 में अन्य चरणों पर भी लागू होता है और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करता है।
  4. अनबाउंड स्ट्रेप्टाविडिन को हटाने के लिए, प्रति वॉश T50 वॉश बफर (20 एमएम ट्रिस एचसीएल, पीएच 7.0, 50 एमएम एनएसीएल, 0.2 यू/μL RNase अवरोध रिएजेंट) की 3x मात्रा में पिपटिंग करके चैनल को तीन बार धोएं।
    नोट: तरल कचरे को चैनल में वापस बहने से रोकना महत्वपूर्ण है। यदि प्रवाह चैनल का आउटलेट अपशिष्ट संग्रह ट्यूब से जुड़ा नहीं है, तो चैनल से बाहर बहने वाले तरल को अवशोषित करने के लिए आउटलेट के पास एक मुड़ा हुआ ऊतक पेपर रखें।
  5. अनुवाद निकालने को स्थानांतरित करें और सूखी बर्फ से बर्फ में मिलाएं और उन्हें गल जाने दें।
  6. उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखो। माइक्रोस्कोप नमूना धारक को माइक्रोस्कोप चरण में प्रवाह कक्ष के साथ रखें। उद्देश्य संपर्क पर विसर्जन तेल जब तक कवरस्लिप के करीब उद्देश्य लाओ। नमूना चरण को स्थानांतरित करें ताकि प्रवाह चैनल की स्थिति सीधे उद्देश्य लेंस से ऊपर हो।
  7. सॉफ्टवेयर 2 में लेजर शटर खोलें और लेजर तीव्रता के स्तर को समायोजित करें।
  8. माइक्रोस्कोप कंट्रोल टच स्क्रीन पर फोकस टैब चुनें और फोकस सर्च और स्टार्ट बटन पर क्लिक करें। एक बीप सुना है जब एक फोकस विमान सफलतापूर्वक प्राप्त किया जाता है ।
  9. सॉफ्टवेयर 1 में लाइव मोड में प्रवाह चैनल सतह छवि। टच स्क्रीन पर ठीक कदम नियंत्रण के साथ उद्देश्य की स्थिति को समायोजित करके एक तेज छवि के लिए ध्यान अनुकूलित करें।
  10. सॉफ्टवेयर 3 में, प्रवाह चैनल का पता लगाने की सतह के विभिन्न क्षेत्रों में फ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए मंच को स्थानांतरित करें। यदि फ्लोरेसेंस कम है, तो प्रयोग जारी रखें। यदि फ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि अत्यधिक अधिक है, तो प्रवाह चैनल को त्यागने पर विचार करें।
  11. सॉफ्टवेयर 2 में, लेजर शटर बंद करें।
  12. फ्लो चैनल से T50 वॉश बफर को पिपेट करें और तुरंत फ्लो चैनल के लिए बायोटिनाइलेटेड एमआरएनए समाधान के 2x वॉल्यूम में पिपेट करें। 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    नोट: mRNA तैयारी के प्रत्येक बैच के लिए, mRNA सांद्रता और इनक्यूबेशन बार mRNA सतह घनत्व एकल अणु का पता लगाने के लिए आवश्यक प्राप्त करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए । उपयुक्त एमआरएनए सतह घनत्व एंटीबॉडी बाइंडिंग को मध्यस्थता करता है जो फ्लोरोसेंट स्पॉट को ~ 5% से अधिक ओवरलैपिंग के साथ दिखाता है (प्रतिनिधि परिणामदेखें)। शुरुआती बिंदु के रूप में, 2-20 एनएम की एकाग्रता पर बायोटिनाइलेटेड एमआरएनए की सिफारिश की जाती है।
  13. प्रति वॉश अनुवाद संगत बफर की 3x मात्रा को पाइप करके चैनल को तीन बार धोएं।

5. अनुवाद मिश्रण विधानसभा और एकल अणु का पता लगाने के लिए एक प्रवाह चैनल के लिए वितरण

  1. बर्फ पर, चरण 1.7 से थोक अनुवाद प्रोटोकॉल के बाद एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में अनुवाद मिश्रण30 के 3x वॉल्यूम इकट्ठा करें, सिवाय इसके कि फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एंटीबॉडी की अनुकूलित एकाग्रता के साथ एमआरएनए और पूरक को छोड़ दें। ट्यूब के नीचे अनुवाद मिश्रण इकट्ठा करने के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को संक्षेप में स्पिन करें।
    नोट: परख स्थापित करते समय, विभिन्न एंटीबॉडी सांद्रता का परीक्षण किया जाता है। इष्टतम एकाग्रता का पता लगाने की सतह के लिए बाध्यकारी गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी की कम मात्रा और नवजात पेप्टाइड के लिए तेजी से एंटीबॉडी बाध्यकारी दिखाती है (परख अंशांकन विवरण के लिए क्रमशः चरण 7.1. और 7.2.देखें)।
  2. अनुवाद मिश्रण को 0.7 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब कैप के अंदर स्थानांतरित करें। सिरिंज पंप को वापस लेने के मोड में सेट करें। अनुवाद मिश्रण में पंप ट्यूबिंग अंत डालें। पंप ट्यूबिंग में अनुवाद मिश्रण इकट्ठा करने के लिए सिरिंज वापसी शुरू करें। डिस्पेंसिंग मोड में सिरिंज पंप सेटिंग को रिवर्स करें और अनुवाद मिश्रण वितरण के लिए प्रवाह को इष्टतम दर पर सेट करें।
    नोट: इसे पंप ट्यूबिंग में स्थानांतरित करते समय अनुवाद मिश्रण में बुलबुले पैदा करने से बचें। अनुवाद मिश्रण को टयूबिंग के हिस्से में बहुत गहरा वापस लेने से बचें जो साफ नहीं था और चरण 3.6 में कुल्ला किया गया था। परख स्थापित करते समय, इष्टतम दर निर्धारित करने के लिए विभिन्न वितरण प्रवाह दरों का परीक्षण किया जाता है (परख अंशांकन पर विवरण के लिए चरण 6.2 देखें)।
  3. यदि ट्यूबिंग एंड और अनुवाद मिश्रण के बीच कोई अंतर है, तो सिरिंज पंप शुरू करें और अनुवाद मिश्रण को ट्यूबिंग अंत तक पहुंचने दें, फिर सिरिंज पंप को रोकें।
  4. प्रवाह चैनल के प्रवेश में पंप ट्यूबिंग अंत डालें। कनेक्शन प्रदर्शन करते समय अनुवाद मिश्रण में हवा के बुलबुले पेश करने से बचें। माइक्रोस्कोप नमूना धारक प्लेट पर कस्टम निर्मित धातु ब्रैकेट पंगा लेना द्वारा कनेक्शन को स्थिर करें। माइक्रोस्कोप फोकस और इमेजिंग एरिया फ्लोरेसेंस का आकलन करें।
    नोट: टयूबिंग को एक कस्टम भाग के साथ प्रवाह कक्ष में दबाया जा सकता है जैसा कि पहले३३वर्णित है । इसपरखके लिए अन्य प्रकार की द्रव प्रणालियों का भी उपयोग किया जा सकता है । देखने का क्षेत्र ट्यूबिंग को जोड़ने से पहले और बाद में समान दिखाई देना चाहिए। यदि कनेक्शन के बाद अधिक फ्लोरोसेंट स्पॉट दिखाई देते हैं, तो अनुवाद मिश्रण डिलीवरी ट्यूबिंग से लीक होने की संभावना है। आवेदन के आधार पर, लीक अनुवाद मिश्रण के साथ चैनल को त्यागने की आवश्यकता हो सकती है।
  5. पुष्टि करें कि फिल्म अधिग्रहण पैरामीटर सही हैं और फ़ाइलों को सहेजने के लिए उपयुक्त फाइलनाम और निर्देशिका दर्ज की गई है।
  6. प्रवाह चैनल का पता लगाने की सतह के केंद्र में एक क्षेत्र छवि के लिए मंच ले जाएँ। माइक्रोस्कोप कंट्रोल टच स्क्रीन पर, निरंतर वायु सेना टैब का चयन करें और प्रयोग के दौरान फोकल स्थिति बनाए रखने के लिए फोकस सर्च और स्टार्ट बटन पर क्लिक करें। एक बीप सुना है जब एक फोकस विमान सफलतापूर्वक प्राप्त किया जाता है ।
  7. सॉफ्टवेयर 2 में लेजर शटर खोलें। सॉफ्टवेयर 1 में रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए टेक सिग्नल बटन पर क्लिक करें। रिकॉर्डिंग के लगभग 5 एस के बाद, प्रवाह चैनल में अनुवाद मिश्रण देने के लिए Coolterm में रन कमांड दर्ज करें। 0.5-2 एस/फ्रेम के समय संकल्प के साथ 2 घंटे तक का रिकॉर्ड।
    नोट: डेटा अधिग्रहण की अधिकतम अवधि इस बात पर निर्भर करती है कि अनुवाद निकालने समय के साथ गतिविधि को कितनी तेजी से खो देता है, जिसे आसानी से लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर एमआरएनए के साथ थोक सेल-मुक्त अनुवाद करने और विभिन्न समय बिंदुओं35पर अनुवाद प्रतिक्रियाओं में लूसिफ़ेरेस गतिविधि को मापने की विशेषता हो सकती है।
  8. जब डेटा अधिग्रहण पूरा हो गया है, लेजर बंद कर दें, माइक्रोस्कोप नियंत्रण टच स्क्रीन पर निरंतर वायु सेना बंद करें, और प्रवाह कक्ष से टयूबिंग को अलग करें।
  9. फ्लो चैनल इनलेट से अनुवाद मिश्रण को पिपेट करें, इसे माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और तरल नाइट्रोजन में ट्यूब रखकर समाधान को स्नैप-फ्रीज करें। बाद में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  10. सिरिंज पंप ट्यूबिंग को तीन बार RNase-मुक्त पानी के साथ धोएं, फिर 70% इथेनॉल के साथ तीन बार। भंडारण के लिए सिरिंज पंप ट्यूबिंग में 70% इथेनॉल वापस लें।
  11. माइक्रोस्कोप और सभी सामान बंद कर दें। साफ करना।

6. डेटा विश्लेषण

नोट: इस परख के लिए डेटा विश्लेषण एकल अणु जैव भौतिक अध्ययन में आम तरीकों की आवश्यकता है । मौजूदा एल्गोरिदम और सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सभी गणना गहन कदम प्राप्त किए जा सकते हैं (संदर्भ उनके संबंधित चरणों में नीचे शामिल हैं)।

  1. वैकल्पिक: यदि लागू हो, तो अधिग्रहीत छवि श्रृंखला फ़ाइल को एक प्रारूप में परिवर्तित करें जो चुने हुए छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर या प्रोग्रामिंग भाषा के साथ संगत है।
  2. अनुवाद प्रतिक्रिया प्रारंभिक बिंदु और अभिकर्ण विनिमय समय निर्धारित करें।
    नोट: अनुवाद मिश्रण में फैलाना फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के कारण, अनुवाद संगत बफर से अनुवाद मिश्रण करने के लिए इन-चैनल रिएजेंट एक्सचेंज के दौरान एक इमेज्ड क्षेत्र की पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस तीव्रता में वृद्धि होगी। अनुवाद प्रतिक्रिया प्रारंभिक बिंदु समय बिंदु के रूप में सेट किया गया है जब अभिकर्ण विनिमय पूरा हो गया है। यह पूर्णता बिंदु अनुवाद मिश्रण वितरण के दौरान पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने और समय बिंदु की पहचान करके पाया जाता है जब बढ़ती फ्लोरेसेंस तीव्रता पठार15,जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. प्रति छवि फ्रेम कुल फ्लोरेसेंस मायने रखता है की गणना करें और इसी समय प्रोफ़ाइल को प्लॉट करें। समय प्रोफ़ाइल साजिश में कुल फ्लोरेसेंस में अचानक वृद्धि की पहचान करें।
      नोट: कुल फ्लोरेसेंस वृद्धि रिएजेंट एक्सचेंज के दौरान फ्लोरोसेंटी लेबल एंटीबॉडी की बढ़ती एकाग्रता के कारण है।
    2. कुल फ्लोरेसेंस वृद्धि चरण के अंतिम बिंदु की पहचान करें और अनुवाद प्रतिक्रिया के प्रारंभिक बिंदु (यानी, समय 0) के रूप में इस समय बिंदु निर्धारित करें। कुल फ्लोरेसेंस वृद्धि चरण के शुरू और अंत दोनों बिंदुओं की पहचान करें और समय अंतर को अभिकर्मक विनिमय समय के रूप में निर्धारित करें।
      नोट: रिएजेंट एक्सचेंज का कुल समय-अवधि प्रवाह चैनल आयामों और चयनित प्रवाह दर पर निर्भर करता है। यह संभव है कि कुछ अनुवाद कारक रिएजेंट एक्सचेंज पूरा होने से पहले एमआरएनए के लिए बाध्यकारी शुरू कर सकते हैं, जो निर्धारित पहले दौर के दीक्षा समय के संकल्प को कम कर सकता है। इसलिए परख स्थापित करते समय विभिन्न प्रवाह दरों का परीक्षण करने और प्रवाह दरों का चयन करने की सिफारिश की जाती है जो 0.5-2 एस/फ्रेम की डेटा अधिग्रहण गति के लिए 3-4 एस के भीतर अभिकर्षक विनिमय पूरा करने की अनुमति देते हैं।
  3. वैकल्पिक: फिल्म बहाव सुधार प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: माइक्रोस्कोप भागों और सामान के बहाव के कारण डेटा छवि में बाध्य एंटीबॉडी की स्थिति समय के साथ बदल सकती है। बहाव है कि एक फिल्म में नेत्रहीन ध्यान देने योग्य है डेटा विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले सुधार की आवश्यकता है । कई स्थानिक बहाव सुधार एल्गोरिदम और लिपियां उपलब्ध हैं36,37,38.
    1. प्रत्येक छवि में, पिक्सेल-स्तर सटीकता के साथ प्रत्येक फ्रेम में बंधे एंटीबॉडी की स्थिति निर्धारित करने के लिए पिक्सेल गिनती में स्थानीय मैक्सिमा ढूंढें। पिक्सेल काउंट के लिए एक सीमा निर्धारित करें जैसे कि केवल उन स्पॉट्स का चयन किया जाता है जो पृष्ठभूमि शोर से ऊपर स्पष्ट रूप से होते हैं।
    2. लगातार दो छवि फ्रेम के बीच प्रत्येक दिशा में व्यक्तिगत एंटीबॉडी पदों के परिवर्तनों की गणना करें।
    3. लगातार दो फ्रेम के बीच एंटीबॉडी स्थितीय परिवर्तनों के हिस्टोग्राम को प्लॉट करें और प्रत्येक दिशा के लिए अलग से ऐसा करें। गॉसियन प्रत्येक हिस्टोग्राम को फिट करता है और लगातार दो फ्रेम के बीच दिशात्मक बहाव के रूप में चोटियों की केंद्र स्थिति निर्धारित करता है।
    4. मनाया बहाव प्रतिक्रिया करने के लिए, गणना बहाव राशि द्वारा विपरीत दिशा में प्रत्येक छवि फ्रेम बदलाव।
  4. एकल अणु प्रक्षेप पथ का निर्माण करें।
    नोट: डिटेक्शन/ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर उज्ज्वल धब्बों की पहचान करने और डेटा इमेज श्रृंखला39,40से उनकी तीव्रता निकालने के लिए उपलब्ध है।
    1. चरण 6.3.1 में वर्णित एंटीबॉडी पदों की पहचान करें।
      नोट: दृश्य निरीक्षण की सिफारिश की जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि चुनी गई सीमा कणों के अत्यधिक अधिक या कम उठा को जन्म नहीं देती है। दृश्य निरीक्षण प्रत्येक छवि फ्रेम पर पहचानी गई सेंट्रोइड पदों को ओवरले करके और नेत्रहीन उनके समझौते का आकलन करके प्राप्त किया जा सकता है (प्रतिनिधि परिणामदेखें)।
    2. सभी फ्रेम से उठाया कणों गठबंधन और अनावश्यक कण पदों को दूर।
    3. नेत्रहीन बाध्य एंटीबॉडी की छवियों का निरीक्षण करें और पिक्सेल को एक वर्ग क्षेत्र का चयन करें जो स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि से ऊपर हैं और व्यक्तिगत रूप से बाध्य एंटीबॉडी के प्रतिनिधि हैं।
      नोट: प्वाइंट स्प्रेड फ़ंक्शन (यानी, एक ही अणु के लिए वर्ग का आकार) ऑप्टिकल सेटअप और डिटेक्टर पिक्सेल आकार द्वारा निर्धारित किया जाता है।
    4. प्रत्येक कण की स्थिति के लिए, कण की स्थिति के आसपास वर्ग क्षेत्र में सभी पिक्सेल की कुल तीव्रता की गणना करके एक एकल अणु प्रक्षेपवक्र का निर्माण करें। प्रक्षेप पथ प्रत्येक स्थिति के लिए निर्माण कर रहे हैं, फ्रेम द्वारा फ्रेम, और पूरे डेटा फिल्म के लिए ।
  5. वैकल्पिक: एकल-अणु प्रक्षेप पथ में पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए एक गैर-रैखिक फॉरवर्ड-बैकवर्ड फिल्टर41 लागू करें।
  6. वैकल्पिक: मौजूदास्टेप-डिटेक्शन एल्गोरिदम42, 43,44,45के साथ डिजिटाइज प्रक्षेप पथ।
    नोट: स्टेप-डिटेक्शन एल्गोरिदम का चुनाव एकल-अणु गतिशीलता की जटिलता पर निर्भर करता है। केवल अलग राइबोसोम अनुवाद (यानी कोई पॉलीसोम गठन) और शोर अनुपात के लिए अच्छा संकेत के सरलतम परिदृश्य के लिए, फ्लोरेसेंस काउंट के लिए एक सीमा आवेदन एकल अणु प्रक्षेप पथ में एंटीबॉडी बाध्यकारी और वियोजन घटनाओं के समय की पहचान करने के लिए पर्याप्त है। प्रत्येक स्थिति के लिए कम से कम 100 प्रक्षेप पथों के दृश्य निरीक्षण की सिफारिश की जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कदम-पता लगाने की रणनीति द्वारा प्रक्षेप पथ कदमों का उचित चयन किया गया है।
  7. प्रत्येक प्रक्षेप पथ (यानी, पहले आगमन समय, टी1)के लिए पहली एंटीबॉडी बाध्यकारी घटना का समय निर्धारित करें, या तो डिजिटाइज्ड प्रक्षेप पथ का उपयोग करना या अनडिगिटीकृत प्रक्षेप पथ पर एक सीमा लागू करना।
    नोट: पहले आगमन समय वितरण के औसत मूल्य की तुलना विभिन्न अनुवाद स्थितियों के बीच की जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, पहले आगमन समय वितरण को औसत मूल्य15 और एलटी; टी 1 और जीटी; निर्धारित करने के लिए स्थानांतरित (3-पैरामीटर) लॉग-सामान्य कार्य में फिट किया जासकताहै। क्योंकि पहले आगमन के समय वितरण आम तौर पर विषम है और एक लंबी पूंछ है, सीधे मनाया पहले आगमन के समय पर औसत से मतलब की गणना नहीं है ।
  8. वैकल्पिक: औसत पेप्टाइड संश्लेषण दर का समय विश्लेषण और गणना करना।
    1. प्रत्येक प्रक्षेपवक्र में मोनोसोम (एकल राइबोसोम) अनुवाद घटनाओं की पहचान करने के लिए डिजिटाइज्ड प्रक्षेप पथ का उपयोग करें और एकल बाध्यकारी घटना की गणना करें, क्योंकि इसी एंटीबॉडी बाध्यकारी और वियोजन घटनाओं के बीच समय का अंतर है।
      नोट: डिजिटाइज़िंग प्रक्षेप-पथ के लिए स्टेप-डिटेक्शन एल्गोरिदम आम तौर पर कम विश्वसनीय होते हैं जब कई आणविक घटनाएं समय पर ओवरलैप होती हैं। इसलिए निवास समय विश्लेषण से पॉलीकुछ घटनाओं को छोड़कर सिफारिश की जाती है। अत्यधिक सक्रिय अनुवाद प्रणालियों के लिए जो पॉलीसम घटनाओं से समृद्ध होते हैं और कभी-कभी मोनोसोम इवेंट्स प्रदर्शित करते हैं, लेबल और अवेलेबल एंटीबॉडी के मिश्रण का उपयोग एकल-अणु प्रक्षेप पथ में अलग-थलग अनुवाद घटनाओं को देखने की संभावना को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।
    2. एक लॉग-सामान्य फ़ंक्शन में वितरण फिट करें और औसत निवास समय की गणना करने के लिए फिट फ़ंक्शन का उपयोग करें।
      नोट: मनाया निवास समय औसत से सीधे मतलब की गणना की सिफारिश नहीं की है क्योंकि निवास समय वितरण आम तौर पर लंबी पूंछ के साथ विषम हैं ।
    3. ओआरएफ कोडन की कुल संख्या से एपिटोप अमीनो एसिड की लंबाई और 35 (राइबोसोम निकास सुरंग के भीतर नवजात पेप्टाइड की औसत अमीनो एसिड लंबाई) के योग को घटाकर एंटीबॉडी बाध्यकारी निवास समय के दौरान अनुवादित अमीनो एसिड की संख्या निर्धारित करें।
    4. औसत पेप्टाइड संश्लेषण दर निर्धारित करने के लिए, औसत निवास समय से अनुवादित अमीनो एसिड की संख्या को विभाजित करें।
  9. वैकल्पिक: औसत पहले दौर के दीक्षा समय की गणना (<टी1_Iऔर gt;) ।
    नोट: दीक्षा स्थल अनुक्रम संदर्भ और कोडिंग अनुक्रम जैसी दीक्षा और विस्तार की स्थिति आम तौर पर दीक्षा काइनेटिक्स के अध्ययन के लिए जानबूझकर संरक्षित होती है। इसलिए, औसत प्रथम आगमन समय और एलटी;टी1और जीटी; चरण 6.7 से। विभिन्न परिस्थितियों के बीच पहले दौर दीक्षा काइनेटिक्स में परिवर्तन की गणना करने के लिए सीधे उपयोग किया जा सकता है। निम्नलिखित सुधार केवल पहले दौर के दीक्षा समय के वास्तविक मूल्य का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है।
    1. एपिटोप लंबाई और 35 (राइबोसोम निकास सुरंग के भीतर नवजात पेप्टाइड की औसत अमीनो एसिड लंबाई) को औसत पेप्टाइड संश्लेषण दर (चरण 6.8.4 से) द्वारा विभाजित करें ताकि इस एन-टर्मिनल क्षेत्र (<टी1_tagऔर जीटी;) के औसत पेप्टाइड विस्तार समय की गणना की जा सके।
    2. चूंकि पहली बार आगमन का समय पहले दौर के दीक्षा समय और टी1_tag,घटाना और एलटी;टी1_tagऔर जीटी; औसत पहले दौर के दीक्षा समय और लेफ्टिनेंट,टी1और जीटीसे है, जो औसत पहलेदौर के दीक्षा समय औरलेफ्टिनेंट,टी1_Iऔर जीटी1_tag1_Iकी गणना करने के लिए है।

7. परख अंशांकन

नोट: शुरू में परख स्थापित करते समय निम्नलिखित अंशांकन चरणों को करें।

  1. एंटीबॉडी बाध्यकारी विशिष्टता की जांच करने के लिए, धारा 4 और 5 में प्रोटोकॉल चरणों को अलग से बिना टैग और टैग किए गए mRNAs(चित्रा 2)के लिए करें। इन संबंधित एमएमएनए के साथ चैनलों में एंटीबॉडी बाध्यकारी स्तर पता लगाने की सतह और नवजात पेप्टाइड के लिए बाध्यकारी विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी की सीमा का प्रतिनिधित्व करते हैं।
    नोट: गैर-विशिष्ट बाध्यकारी अनुपात के लिए विशिष्ट और जीटी;10 होने की सिफारिश की जाती है और विभिन्न सतह निष्क्रियता रणनीतियों, कम एंटीबॉडी एकाग्रता, या उच्च एमआरएनए सतह घनत्व के साथ बढ़ाया जा सकता है।
  2. एंटीबॉडी बाइंडिंग की दर को मापने के लिए, चरण 4 और चरण 5 के बीच एक अतिरिक्त कदम के साथ प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करें।
    1. चरण 4 के बाद, अनुवाद मिश्रण के साथ चैनल को इनक्यूबेट करें जिसमें प्री-जेनरेट mRNA/राइबोसोम/पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स के लिए एंटीबॉडी का अभाव है ।
    2. फिर 5 कदम और चैनल में एंटीबॉडी पूरक अनुवाद मिश्रण प्रवाह के लिए आगे बढ़ें ।
    3. पहले आगमन समय हिस्टोग्राम के लिए घातीय फिटिंग के साथ पूर्व-जनित नवजात पेप्टाइड के लिए औसत एंटीबॉडी बाध्यकारी दर की मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: पूर्व-जनित पेप्टाइड के लिए बाध्यकारी एंटीबॉडी सेकंड के क्रम पर तेजी से होना चाहिए, और अनुवाद काइनेटिक्स की तुलना में तेजी से होना चाहिए। एंटीबॉडी बाध्यकारी दर को बढ़ाने के लिए एक उच्च एंटीबॉडी एकाग्रता का उपयोग किया जा सकता है।
  3. फ्लोरोफोर लेबल एंटीबॉडी की फोटोस्थेबिलिटी।
    1. चरण 2 में प्रोटोकॉल के अनुसार एक स्लाइड तैयार करें लेकिन पेगेलेशन चरण को छोड़ दें। लवणीकरण कदम के बाद प्रवाह कक्ष को इकट्ठा करें। सिलेन कोटिंग कुशल गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी को पहचानने वाली सतह के लिए बाध्यकारी होने की अनुमति देता है।
    2. पता लगाने की सतह के लिए बाध्यकारी गैर विशिष्ट एंटीबॉडी के एकल अणु घनत्व को प्राप्त करने के लिए चैनल में फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी जोड़ें । फ्लोरोसेंटली-लेबल एंटीबॉडी को जोड़कर शुरू करें जो T50 वॉश बफर में अत्यधिक पतला होता है और वांछित एकल-अणु घनत्व प्राप्त होने तक एंटीबॉडी एकाग्रता को धीरे-धीरे बढ़ाता है।
    3. छवि का पता लगाने की सतह जब तक एंटीबॉडी फ्लोरेसेंस के अधिकांश अब पता लगाने योग्य नहीं है ।
    4. फ्लोरोफोर फोटोब्लैचिंग के कारण एंटीबॉडी फ्लोरेसेंस लॉस की दर का आकलन करने के लिए समय के साथ दृश्यमान एंटीबॉडी की कुल संख्या को प्लॉट करें।
      नोट: एंटीबॉडी लेबलिंग आमतौर पर प्रति एंटीबॉडी कई फ्लोरोफोरस पैदावार। व्यक्तिगत एंटीबॉडी तब तक पता लगाने योग्य रहते हैं जब तक कि सभी संयुग्मित फ्लोरोफोरस फोटोब्लाच न हो जाए।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल के बाद 3 ' अंत-सीमित रिपोर्टर एमआरएनए(चित्रा 1)के सक्रिय सेल-मुक्त अनुवाद के दौरान एकल अणु संकल्प के साथ नवजात एन-टर्मिनल-टैग किए गए पॉलीपेप्टाइड्स के साथ व्यक्तिगत एंटीबॉडी इंटरैक्शन की इमेजिंग सक्षम बनाता है। तीन सिंथेटिक mRNAs के उपयोग के साथ एक न्यूनतम प्रदर्शन प्रयोग की सूचना दी है: ल्यूक (अनटैग लूसिफ़ेरेस एन्कोडिंग), ल्यूकफ्लैग (एन्कोडिंग 3xFLAG-टैग लूसिफ़ेरेस), और हिमाचल प्रदेश-ल्यूकफ्लैग (5' नेता क्षेत्र में एक स्थिर स्टेम-लूप के साथल्यूकफ्लैग) (चित्रा 2C)। लूसिफ़ेरेस-एन्कोडिंग एमआरएनए का उपयोग एकल-अणु टिप्पणियों और थोक ल्यूमिनेसेंस मापों के बीच तुलना को सक्षम बनाता है। 3 ' बायोटिनाइलेटेड एमआरएनए की अखंडता का आकलन पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) और आरएनए धुंधला द्वारा किया गया था। अच्छी गुणवत्ता वाले एमआरएनए एक भी स्वच्छ बैंड दिखाता है और अतिरिक्त तेजी से माइग्रेट सिग्नल(चित्रा 3A)नहीं दिखाना चाहिए। सैकरोमाइसेस सेरेविसी अनुवाद अर्क का उपयोग यहां किया गया था और एक प्रोटोकॉल के बाद तैयार किया गया था जिसे पहले30 और संशोधित15वर्णित किया गया था। खमीर निकालने और बायोटिनाइलेटेड ल्यूकफ्लैग एमआरएनए के साथ सेल-मुक्त अनुवाद प्रतिक्रियाओं में लूसिफ़ेरेस गतिविधि के थोक माप जो या तो कमी है या इसमें एम7जी कैप है, ल्यूकफ्लैग एमआरएनए अनुवाद(चित्रा 3 बी)की कैप उत्तेजना दिखाता है।

एकल-अणु इमेजिंग के लिए, अनुवाद अर्क को Cy3-लेबल एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी (Cy3-αFLAG) के 67 एनएम के साथ पूरक किया गया था। इस एंटीबॉडी में प्रति एंटीबॉडी 2-7 रंगों का उच्च लेबलिंग अनुपात था। 532 एनएम लेजर उद्देश्य पर 10 μW करने के लिए सेट किया गया था। लेजर घटना कोण 71.5 डिग्री है, जो हमारे सेट अप के लिए 63.8 डिग्री के महत्वपूर्ण कोण से अधिक था करने के लिए सेट किया गया था। फ्लोरेसेंस का एक निम्न स्तर पता लगाने वाली सतहों से चित्रित किया गया था जिसमें एमआरएनए होता है लेकिन अनुवाद मिश्रण(चित्रा 4A)की कमी होती है। लगभग 2 मिमी (चौड़ाई) x 50 माइक्रोन (गहराई) x 24 मिमी (लंबाई) के चैनल आयामों के लिए, 150 माइक्रोल/न्यूनतम की प्रवाह वितरण दर 3 - 4 एस का एक अभिकर्मक विनिमय समय उत्पीलन करती है। अनुवाद मिश्रण वितरण के 5 एस के भीतर, विसरित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के कारण पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस का स्तर बढ़ जाता है। ल्यूकफ्लैग एमआरएनए युक्त चैनलों के लिए अनुवाद मिश्रण वितरण के लगभग 2 मिनट बाद, Cy3 स्पॉट देखने के एक क्षेत्र में दिखाई देने लगे और ~ 30 मिनट(चित्रा 4B)के लिए जमा करना जारी रखा। सतह के लिए बाध्यकारी गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी, 3xFLAG-कमी ल्यूक mRNA(चित्रा 2C)का उपयोग कर मापा, एक बहुत ही निम्न स्तर15पर बने रहे । MRNA/ribosome/पेप्टाइड-बाध्य Cy3-αFLAG से संकेत स्पष्ट रूप से अनुकूलित लेजर घटना कोण के साथ दिखाई दे रहे थे, लेकिन कम लेजर घटना कोण(चित्रा 4C)के साथ एक उच्च फ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि द्वारा नकाबपोश किया जा सकता है ।

Cy3-αFLAG बाध्यकारी घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए, चयनित Cy3-αFLAG स्पॉट(चित्रा 5A)की फ्लोरेसेंस तीव्रता पूरी फिल्म के लिए फ्रेम द्वारा फ्रेम की गणना की गई और फिर एक तीव्रता प्रक्षेपवक्र(चित्रा 5B)बनाने के लिए जुड़े थे । कच्चे प्रक्षेप पथ शोर प्रकट कर सकते हैं और पृष्ठभूमि शोर41को कम करने के लिए एक गैर-रैखिक आगे-पिछड़े फिल्टर के साथ शोधन की आवश्यकता हो सकती है। प्रक्षेप पथ42को डिजिटाइज करने के लिए स्टेप-डिटेक्शन एल्गोरिदम का उपयोग करके और अधिक शोधन प्राप्त किया जा सकता है। सभी प्रक्षेप-पथ के लिए, अनुवाद मिश्रण(चित्रा 5B)में डिफ्यूजिंग फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के कारण रिएजेंट एक्सचेंज के दौरान एक सार्वभौमिक पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस स्तर में वृद्धि दिखाई देती है। एक नवजात पॉलीपेप्टाइड के लिए बाध्यकारी एंटीबॉडी फ्लोरेसेंस में तात्कालिक वृद्धि का कारण बना जबकि एमआरएनए से एंटीबॉडी/पॉलीपेप्टाइड वियोजन एक तात्कालिक फ्लोरेसेंस कम(चित्रा 5B)का कारण बनता है ।

एंटीबॉडी बाइंडिंग के निवास समय का उपयोग खुले पढ़ने के फ्रेम के कुल डिकोडिंग समय को मापने के लिए किया जा सकता है। ल्यूकफ्लैग एमआरएनए के लिए निवास समय हिस्टोग्राम एक लॉग-सामान्य वितरण(चित्रा 6 ए)में फिट बैठता है और प्रति सेकंड15में 2.5 ± 0.1 अमीनो एसिड की पेप्टाइड संश्लेषण दर उत्पिट होता है। पहले आगमन का समय हिस्टोग्राम एक स्थानांतरित (3-पैरामीटर) लॉग-सामान्य फ़ंक्शन(चित्रा 6B) में फिट बैठता है। पहले आगमन के समय हिस्टोग्राम का व्यापक प्रसार एकल एमआरएनए अनुवाद गतिविधि में विषमता की उच्च डिग्री को दर्शाता है। हिस्टोग्राम ने संकेत दिया कि एकल ल्यूकफ्लैग एमआरएनए अणुओं पर पहली पेप्टाइड संश्लेषण घटना 2 मिनट के रूप में शुरू हो सकती है, और अनुवाद मिश्रण वितरण(चित्रा 6B)के बाद 20 मिनट के रूप में देर से शुरू हो सकती है। ल्यूकफ्लैग एमआरएनए के साथ अनुवाद की तुलना में, हिमाचल प्रदेश-ल्यूकफ्लैग एमआरएनए अनुवाद के साथ पहली बार आगमन समय हिस्टोग्राम ने धीमी एंटीबॉडी बाइंडिंग(चित्रा 7A) दिखाया। इन एक ही mRNAs के साथ सेल मुक्त अनुवाद प्रतिक्रियाओं से थोक चिकनाई माप का उपयोग करना, हालांकि, अनुवाद काइनेटिक्स(चित्रा 7बी, सी)में अंतर को हल नहीं करता है । ये परिणाम दीक्षा गतिज में छोटे परिवर्तनों का पता लगाने के लिए थोक गतिज लूसिफ़ेरेस गतिविधि माप की तुलना में हमारी विधि के उच्च संकल्प को प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल प्रवाह चार्ट। कवरलिप और स्लाइड तैयारी, एकल अणु चैंबर असेंबली, टीआईआरएफ इमेजिंग और डेटा अधिग्रहण, और डेटा विश्लेषण कदमों के योजनाबद्ध अभ्यावेदन दिखाए जाते हैं। टीआईआरएफ इमेजिंग स्टेप में एक फ्लो चैनल में एमआरएनए इम्मोबिलाइजेशन और ट्रांसलेशन के योजनाबद्ध चित्रण शामिल हैं । सतह के घटकों का पता लगाने, फ्लोरोसेंटी लेबल एंटीबॉडी, और सेल निकालने के घटकों को इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एमआरएनए एकल अणु परख के लिए डिजाइन करता है। (क)एकल अणु परख के लिए एक थोक अनुवाद परख अनुकूलन करने के लिए, थोक रिपोर्टर ORF के डीएनए टेम्पलेट एक एन टर्मिनल epitope टैग अनुक्रम प्रविष्टि के साथ संशोधित करने के लिए एक टैग रिपोर्टर-एन्कोडिंग ORF उत्पन्न किया गया था । ओआरएफ और एन-टर्मिनल टैग-कोडिंग क्षेत्रों को इंगित किया गया है। (ख)mRNAs 5'm7जी कैप-निर्भर अनुवाद की अनुमति देने के लिए और 3 '-बायोटिनिलेटेड एकल अणु का पता लगाने की सतह के लिए उनके स्थिरीकरण के लिए छाया हुआ था । 5'-m7G कैप और 3'-बायोटिन को अनटाग्ड और टैग किए गए ओआरएफ आरएनए पर दर्शाया गया है। (ग)लूसिफ़ेरेस-एन्कोडिंग एमएचआरएन का उपयोग एकल अणु परख को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था । ल्यूक और ल्यूकफ्लैग एमआरएना ने लूसिफ़ेरेस को एन्कोड किया है जिसमें क्रमशः एन-टर्मिनल 3xFLAG टैग है और इसमें शामिल है। एचपी-ल्यूकफ्लैग एमआरएनए में एक अतिरिक्त प्रविष्टि शामिल है जो ल्यूकफ्लैग एमआरएनए 5′-लीडर में हेयरपिन माध्यमिक संरचना का परिचय देती है। हेयरपिन थर्मोस्थेटाबिलिटी, 3′-पॉली (ए) पूंछ, और 3'-बायोटिन इंगित किए गए हैं। सभी तीन mRNAs अधिक कुशल टोपी पर निर्भर अनुवाद के लिए एक 30 nt 3′-पाली (ए) पूंछ शामिल थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एकल अणु रिपोर्टर mRNA अखंडता और थोक अनुवाद । (A)एकल अणु रिपोर्टर एमआरएनए के पेज इमेजिंग को विकृत करने वाला प्रतिनिधि । 5'-m7G छाया हुआ और 3'-बायोटिनाइलेटेड ल्यूकफ्लैग एमआरएनए को आरएनए सीढ़ी के बगल में 10% पॉलीएक्रीलामाइड जेल पर लोड किया गया था। (ख)एकल अणु रिपोर्टर एमआरएनए ने थोक सेल-मुक्त अनुवाद प्रतिक्रियाओं में 5 ' कैप-निर्भरता को संरक्षित किया । 3'-बायोटिनेलेटेड ल्यूकफ्लैग एमआरएनए जो या तो कमी रह गई थी (-कैप) या निहित (+ कैप) 5'-एम7जी कैप का अनुवाद एस सेरेविसिया अनुवाद अर्क में 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए किया गया था। लूसिफ़ेरेस गतिविधि को दो स्वतंत्र प्रतिक्रियाओं से मापा गया था और -कैप एमआरएनए के साथ गतिविधि को सामान्यीकृत किया गया था, जो मनमाने ढंग से 1.0 पर सेट किया गया है। मतलब मूल्यों से मानक विचलन त्रुटि सलाखों द्वारा इंगित कर रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: स्थिर एमआरएनए युक्त डिटेक्शन सतहों की इमेजिंग। (A)अनुवाद मिश्रण के अभाव में पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस। (ख)Cy3 फ्लोरोसेंट दृश्य के एक क्षेत्र में स्पॉट 30 मिनट अनुवाद मिश्रण वितरण के बाद और एक अनुकूलित लेजर घटना कोण के साथ । (ग)अनुवाद मिश्रण वितरण के बाद 30 मिनट देखने के चित्रित क्षेत्र और एक कम लेजर घटना कोण के साथ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: छवि विश्लेषण। (A)Cy3 देखने के एक क्षेत्र में (बाएं पैनल) या (दाएं पैनल) स्पॉट चयन के साथ स्पॉट । (ख)चयनित Cy3 स्थान के लिए एकल-अणु प्रक्षेपवक्र का उदाहरण । काला तीर अनुवाद मिश्रण वितरण के दौरान एंटीबॉडी को फैलाने के कारण पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस में वृद्धि को इंगित करता है। हरे तीर Cy3-αFLAG बाध्यकारी के कारण फ्लोरेसेंस तीव्रता में अचानक वृद्धि को इंगित करता है। लाल तीर MRNA से Cy3-αFLAG/नवजात पेप्टाइड वियोजन के कारण फ्लोरेसेंस तीव्रता में अचानक कमी को इंगित करता है । एक Cy3-αFLAG बाध्यकारी घटना का निवास समय एक डबल-हेडेड तीर के साथ इंगित किया जाता है। कच्चे, फ़िल्टर और डिजिटाइज्ड डेटा बताए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: ल्यूकफ्लैग एमआरएनए अनुवाद के साथ Cy3-αFLAG बाध्यकारी का गतिज विश्लेषण। (A)Cy3-αFLAG बाध्यकारी समय हिस्टोग्राम एक लॉग-सामान्य वितरण के लिए फिट बैठता है । (ख)Cy3-αFLAG बाध्यकारी पहली आगमन समय हिस्टोग्राम एक स्थानांतरित (3-पैरामीटर) लॉग-सामान्य कार्य करने के लिए फिट बैठता है । अनुमति के साथ वांग एट अल15 से अनुकूलित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7: एकल अणु परख थोक चिकनाई परख की तुलना में दीक्षा काइनेटिक्स के लिए एक उच्च संकल्प है । (क)ल्यूकफ्लैग और एचपी-ल्यूकफ्लैगएमआरएएनए के अनुवाद के साथ Cy3-αFLAG बाध्यकारी के लिए पहले आगमन समय हिस्टोग्राम ने एमआरएनए 5 '-लीडर में एक छोटे हेयरपिन संरचना के कारण धीमी दीक्षा का खुलासा किया। N = 10650 प्रक्षेप पथ(ल्यूकफ्लैग),3 डेटा सेट और एन = 4079 प्रक्षेप पथ(एचपी-ल्यूकफ्लैग)से संयुक्त, 2 डेटा सेट से संयुक्त। (B,C) थोक लूसिफ़ेरेस गतिविधि परख गतिज माप ने ल्यूकफ्लैग (एन = 9 डेटा सेट) और एचपी-ल्यूक फ्लैग (एन = 6 डेटा सेट) एमआरएनए अनुवाद के लिए दीक्षा काइनेटिक्स में अंतर को हल नहीं किया। (ख)बल्क ल्यूमिनेसेंस काइनेटिक्स । (ग)पहले दौर के अनुवाद समय के तितर बितर भूखंडों का निर्धारण गॉसियन फिटिंग द्वारा ल्यूमिनेसेंस काइनेटिक्स वक्र्स के दूसरे व्युत्पन्न कोनिर्धारितकिया गया है, जैसा कि वासिलेंको एट अल द्वारा वर्णित है । 46. लाल हलकों और सलाखों में(सी)गणना पहले दौर अनुवाद समय के औसत मूल्य और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमशः । अनुमति के साथ वांग एट अल15 से अनुकूलित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

विशिष्ट इन विट्रो टीआईआरएफ एकल-अणु प्रयोगों की तुलना में, यहां वर्णित परख के साथ एकल-अणु इमेजिंग सेल एक्सट्रैक्ट के उपयोग और फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी की उच्च एकाग्रता के कारण अतिरिक्त रूप से जटिल है। सतह PEGylation के एक दौर के अधिक आम अभ्यास की तुलना में, PEGylation (चरण 2) का एक दूसरा दौर सतह15का पता लगाने के लिए बाध्यकारी गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी को बहुत कम कर देता है। डिफ्यूजिंग फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी की उच्च एकाग्रता एक अत्यंत उच्च फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि का कारण बनती है जो एंटीबॉडी बाइंडिंग के एकल-अणु का पता लगाने के लिए मास्क करती है। इस फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, लेजर घटना कोण महत्वपूर्ण कोण (चरण 3.4)। एंटीबॉडी डिटेक्शन भी अत्यधिक फ्लोरोफोर अस्थिरता से कम हो जाता है, जो निवास समय की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता को सीमित कर सकता है। इस समस्या का सामना करते समय, फ्लोरोफोर को अधिक फोटोस्टेबल फ्लोरोफोर से बदलें, जैसे कि ट्रिपल-स्टेट क्वेंचर47के लिए संयुग्मित लोग, या लेजर रोशनी तीव्रता को कम करें। यद्यपि ऑक्सीजन स्कैवेंटिंग सिस्टम का उपयोग आमतौर पर इन विट्रो एकल अणु प्रयोगों में फ्लोरोफोर फोटोब्लैचिंग48,49को दबाने के लिए किया जाता है, लेकिन यहां वर्णित परख किसी भी ऑक्सीजन सफाई प्रणाली को लागू किए बिना एक बहुत उदार पहचान खिड़की प्रदान कर सकती है15. इसके अलावा, ऑक्सीजन मैला ढोने की प्रणाली बहुत यूकेरियोटिक सेल मुक्त अनुवाद दक्षता को कम कर सकते हैं । इसलिए, ऑक्सीजन मैला ढोने की प्रणालियों को इस परख के साथ उनके उपयोग से पहले सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

यह बताना महत्वपूर्ण है कि अभिकर्ण तैयारी में छोटे बदलाव ों का पता इसके एकल-अणु संकल्प के कारण परख द्वारा लगाया जाता है । उदाहरण के लिए, अनुवाद निकालने की तैयारी को दोहराने से विभिन्न गतिविधियां प्रदर्शित हो सकती हैं जो थोक तरीकों से पता लगाने योग्य हो सकती हैं या नहीं। इसके अलावा, अनुवाद निकालने और अन्य अभिकर्णों के फ्रीज-गल चक्र तेजी से अनुवाद गतिविधि को ख़राब कर सकते हैं। हम एक व्यवस्थित अध्ययन की योजना बनाने से पहले शर्तों का परीक्षण करने के लिए आसानी से सुलभ सामग्री के साथ छोटे पैमाने पर प्रायोगिक प्रयोग करने की सलाह देते हैं। एक व्यवस्थित अध्ययन के लिए, अनुवाद अभिकर्णों की बड़े पैमाने पर तैयारी, फ्रीज/गल-संवेदनशील अभिकर् ता के लिए एकल उपयोग वाले एलिकोट्स, और प्रोटोकॉल चरणों के प्रदर्शन में निरंतरता की सिफारिश की जाती है । अनुवाद निकालने कि तरल नाइट्रोजन में फ्लैश जमे हुए है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कम से कम दो साल के लिए न्यूनतम गतिविधि हानि से पता चलता है। इन उपायों के आवेदन प्रभावी ढंग से प्रयोगात्मक विविधताओं को दबाने और एकल अणु परख की मजबूती में वृद्धि कर सकते हैं ।

चूंकि यह विधि मौजूदा थोक सेल-मुक्त अनुवाद प्रणालियों और इन विट्रो एकल-अणु इमेजिंग तकनीकों को जोड़ती है, इसलिए इन दोनों क्षेत्रों में सामान्य समस्याओं के निवारण पर यहां चर्चा नहीं की जाती है । ऐसे सामान्य मुद्दों के उदाहरणों में रिपोर्टर एमआरएनए या पेग्यालेटेड कवर्लिप की कम गुणवत्ता की तैयारी और सेल एक्सट्रैक्ट की कम अनुवाद गतिविधि शामिल है। यहां, हम इस विधि के लिए विशिष्ट मुद्दों पर ध्यान केंद्रित करेंगे। प्रोटोकॉल में चर्चा किए गए कई तकनीकी मुद्दों के अलावा, एक और संभावित समस्या अनुवाद की स्थिति के लिए प्रवाह चैनल में कम या कोई एंटीबॉडी बाध्यकारी नहीं हो सकती है जिसमें अच्छी गतिविधि की उम्मीद है। समस्या निवारण के लिए कई संभावनाएं हैं। पता लगाने की सतह के लिए बायोटिनाइलेटेड मर्ना इम्मोबिलाइजेशन की दक्षता का आकलन पूरक और फ्लोरोफोर-कंजूज्ड डीएनए ओलिगोमर्स को स्थिर एमआरएनए और इमेजिंग फ्लोरोसेंट डीएनए: आरएनए डुप्लेक्स द्वारा किया जा सकता है। ट्रांसलेशन मिक्स और बायोटिनेलेटेड रिपोर्टर एमआरएन की क्वालिटी को बल्क ट्रांसलेशन परख चलाकर चेक किया जा सकता है। इसके अलावा, एक mRNA-immobilized प्रवाह चैनल में एक अनुवाद प्रतिक्रिया बाहर ले जाने के बाद, अनुवाद प्रतिक्रिया समाधान चैनल से बाहर पाइप और एक रिपोर्टर गतिविधि परख में इस्तेमाल के लिए में चैनल अनुवाद की घटना की पुष्टि कर सकते हैं । यदि आवश्यक हो, तो रिपोर्टर गतिविधि परख द्वारा आसान पता लगाने की अनुमति देने के लिए इन-चैनल अनुवाद प्रतिक्रिया के लिए अत्यधिक उच्च एमआरएनए सतह घनत्व का उपयोग किया जा सकता है।

इस परख की प्रमुख सीमा दीक्षा काइनेटिक्स के लिए इसका संकल्प है। इस परख में, प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक उत्पादन, पहले आगमन का समय, एपिटोप और 35 अतिरिक्त कोडन का अनुवाद करने के लिए पहले दौर के दीक्षा समय और पेप्टाइड विस्तार समय दोनों शामिल हैं। यद्यपि पेप्टाइड विस्तार समय के योगदान को ठीक किया जा सकता है (चरण 6.9.), यह परख परिणामस्वरूप मिनटों के क्रम पर होने वाली दीक्षा काइनेटिक्स को मापने के लिए सबसे संवेदनशील है, जो कैप-निर्भर दीक्षा15की सामान्य संपत्ति प्रतीत होती है। प्रायोगिक रूप से, अन्य दीक्षा तंत्रों का अध्ययन करने के लिए इस परख को अनुकूलित करना आसान है। हालांकि, यदि एक दीक्षा तंत्र सेकंड के क्रम पर काफी तेजी से होता है, तो इस परख से दीक्षा काइनेटिक्स को हल करने की संभावना नहीं है।

यहां वर्णित एकल-अणु दृष्टिकोण वास्तविक समय में और सक्रिय सेल-मुक्त अनुवाद के दौरान व्यक्तिगत कैप-निर्भर अनुवाद घटनाओं के माप को सक्षम करने के लिए एकल-अणु इमेजिंग और एक्सट्रैक्ट-आधारित अनुवाद को जोड़ती है। परख एक थोक अनुवाद परख से एक एकल अणु परख करने के लिए आसान संक्रमण की अनुमति देता है, जबकि थोक अनुवाद गतिज के संरक्षण । इस प्रकार, एकल अणु गतिज टिप्पणियों इसी थोक परिणामों के लिए सीधे संदर्भ में व्याख्या की जा सकती है । पिछले तरीकों, जिनमें हाल ही मेंवीवो दृष्टिकोण11,12, 13,14 शामिल हैं, व्यक्तिगत अनुवाद दीक्षा घटनाओं के गतिज माप के लिए संकल्प की कमी है और प्रयोगात्मक अवलोकन से दीक्षा समय औसत निकालने के लिए अनुवाद तंत्र की मान्यताओं की आवश्यकता होती है। यहां प्रस्तुत एकल अणु विधि सक्रिय कैप-निर्भर अनुवाद के औसत दीक्षा समय की मात्रा निर्धारित करने के लिए पहली परिकल्पना मुक्त दृष्टिकोण प्रदान करती है। इसके अलावा, हालांकि एक ल्यूमिनेसेंस परख के साथ थोक गतिज माप का उपयोग कैप-निर्भर अनुवाद गतिज के सबसे मात्रात्मक और व्यवस्थित थोक लक्षण प्रदान करने के लिए किया गया है46,50,एकल अणु परख यहां वर्णित थोक परख(चित्रा 7)की तुलना में अधिक संवेदनशीलता के साथ औसत दीक्षा गतिज परिवर्तन को मापता है। इसके अलावा, एकल अणु डेटा एकल एमआरएनए अनुवाद स्टोचस्टिकिटी और विषमता को बरकरार रखता है, ऐसे गुण जो थोक माप में औसत होते हैं। अनुवाद गतिज के एकल अणु संकल्प का उपयोग व्यवस्थित गतिज विश्लेषणों के लिए किया जा सकता है ताकि अन्य तरीकों के साथ अप्राप्य अनुवाद तंत्र की अंतर्दृष्टि प्रकट की जा सके।

यह परख मौजूदा जैव रासायनिक और आनुवंशिक दृष्टिकोण है कि आमतौर पर अनुवाद अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है के साथ संगत है । उदाहरण के लिए, किसी विशिष्ट कारक के अनुवादात्मक कार्य का अध्ययन कारक-समाप्त अर्क उत्पन्न करके और इसे जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती कारक के साथ पूरक करके किया जा सकता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले कारक को पूरक करके, अध्ययन संभावित रूप से कारक बाध्यकारी और अनुवाद की प्रगति के बीच गतिज संबंध की जांच कर सकते हैं। दो अलग एपिटोप/एंटीबॉडी जोड़े के उपयोग के साथ, इस प्रोटोकॉल को संभवतः एक रंग परख से दो रंग की परख तक विस्तारित किया जा सकता है जो दो अलग-अलग कोडिंग दृश्यों का एक साथ पता लगाने में सक्षम बनाता है। यह अनुकूलन विभिन्न रीडिंग फ्रेम के अनुवाद को ट्रैक करने की अनुमति देगा और फ्रेमशिफ्टिंग और साइट चयन अध्ययन शुरू करने के लिए लागू किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, व्यक्तिगत mRNAs पर अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम अनुवाद घटनाओं की निगरानी के लिए अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम ओपन रीडिंग फ्रेम द्वारा एन्कोड किए गए टैग किए गए पॉलीपेप्टाइड्स के साथ एंटीबॉडी इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए दो रंग प्रणाली का उपयोग किया जा सकता है। ये विस्तार मशीनी अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला को सक्षम कर सकते हैं जो कैप-निर्भर अनुवाद और इसके नियमन की जांच करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [R01GM121847] द्वारा समर्थित किया गया था; मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर (MSKCC) समर्थन अनुदान/कोर ग्रांट (P30 CA008748); और एमएसकेसीसी कार्यात्मक जीनोमिक्स पहल।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X oil objective, N.A. 1.49 Olympus UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1) Bio-Rad 161-0144
Alkaline liquid detergent Decon 5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCT Specialties, LLC A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD Andor DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software Andor For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter Chroma 532/640/25
Band-pass filter Chroma NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio Inc Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid Prolume 309-250
Coolterm software For controlling the syringe pump
Desktop computer Dell For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror Semrock R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX Fisher Scientific NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Epoxy Devcon 14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid Prolume 306-250
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP1185500
Hydrogen perioxide Sigma-Aldrich 216763-500ML
Immersion oil Olympus Z-81226A Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System Promega E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit Thermo fisher AM1334
Methanol Fisher Scientific MMX04751
Microscope Olympus IX83
Microscope slide Thermo Scientific 3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 Sigma-Aldrich A9594
mPEG-SVA Laysan Bio Inc mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4 Thermo Scientific 22341
NaCl (5M) Thermo Scientific AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass Fisherband 12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM Olympus digital Laser system CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software Olympus For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table TMC vibration control 63-563 With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix Sigma-Aldrich 77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit Thermo Scientific 20160
Potassium hydroxide pellets Sigma-Aldrich P1767-500G
Prior motorized XY translation stage Prior PS3J100
Prior PriorTest software Prior For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor Promega N2515
Stage top Incubator In vivo scientific (world precision Instruments) 98710-1 With a custom built acrylic cage
Staining jar Fisher Scientific 08-817
Streptavidin Thermo Scientific 43-4301
Sulfuric acid Fisher Scientific A300212
SYBR green II Fisher Scientific S7564
Syringe Hamilton 1725RN
Syringe pump Harvard apparatus 55-3333
Tris (1M), pH = 7.0 Thermo Scientific AM9850G
Ultrasonic Bath Branson CPX1800H
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Vaccinia Capping system New England Biolabs M2080S
Zymo-Spin IC Columns Zymo Research C1004

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Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics. J. Vis. Exp. (163), e61648, doi:10.3791/61648 (2020).

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