Un test di germinazione coroide ex vivo di angiogenesi microvascolare oculare
Summary
Questo protocollo presenta il saggio di germinazione coroide, un modello ex vivo di proliferazione microvascolare. Questo saggio può essere utilizzato per valutare le vie coinvolte nei micro vasi cororoidali proliferano e valutare i trattamenti farmacologici utilizzando tipi selvatici e tessuti di topo geneticamente modificati.
Abstract
L’angiogenesi coroiroidale patologica, una caratteristica saliente della degenerazione maculare legata all’età, porta a compromissione della vista e cecità. I test di proliferazione delle cellule endoteliali (CE) che utilizzano cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC) o EC retiniche primarie isolate sono ampiamente utilizzati modelli in vitro per studiare l’angiogenesi retinica. Tuttavia, isolare le cellule endoteliali retiniche murine pure è tecnicamente impegnativo e gli EC retinali possono avere risposte di proliferazione diverse rispetto alle cellule endoteliali coroidiali e alle diverse interazioni cellula/cellula. È stato sviluppato un saggio di germinazione coroidea ex vivo altamente riproducibile come modello di proliferazione microvascolare coroiroidale. Questo modello include l’interazione tra vascucolatura coroide (EC, macrofagi, periciti) e epitelio pigmentato retinico (RPE). Gli espianto di topo RPE/coroide/sclerale sono isolati e incubati nell’estratto di membrana basale (BME) ridotto dal fattore di crescita (giorno 0). Il mezzo viene cambiato a giorni diversi e la germinazione coroide viene quantificata al giorno 6. Le immagini dei singoli espianto coroide vengono scattate con un microscopio a fase invertita e l’area di germogliazione viene quantificata utilizzando un plug-in macro semi-automatizzato al software ImageJ sviluppato in questo laboratorio. Questo saggio di germinazione coroidea ex vivo riproducibile può essere utilizzato per valutare i composti per il potenziale trattamento e per la ricerca sulle malattie microvascolari per valutare le vie coinvolte nella proliferazione dei micro recipienti coroidiali utilizzando tipi selvatici e tessuti di topo geneticamente modificati.
Introduction
La disregolazione dell’angiogenesi coroiroidale è associata alla degenerazione maculare neovascolare legata all’età (AMD)1. La coroide è un letto microvascolare presente sotto l’epitelio pigmentato retinico (RPE). È stato dimostrato che il flusso sanguigno ridotto nella coroide è associato alla progressione dell’AMD2. L’intricata relazione tra endotelio vascolare, RPE, macrofagi, periciti e altre cellule è responsabile dell’omeostasi del tessuto3,4,5. Pertanto, un microambiente coroideo riproducibile che modella il test è fondamentale per lo studio dell’AMD neovascolare.
I test di angiogenesi ex vivo e le colture cellulari endoteliali in vitro possono integrare gli studi sul comportamento microvascolare in vivo, per testare nuovi farmaci e per studi di patogenesi. Cellule endoteliali come le cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC), le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), il cervello animale primario isolato o gli EC retinali sono spesso utilizzati in studi in vitro per la ricerca sull’angiogenesi oculare6,7,8. Gli HRMEC in particolare sono stati ampiamente utilizzati come modello di neovascolarizzazione coroiroidale in vitro (CNV)9 valutando la proliferazione endoteliale, la migrazione, la formazione tubolare e le perdite vascolari pervalutare gli interventi 6,10. Tuttavia, gli EC in coltura sono limitati come modello di CNV a causa della mancanza di interazioni con altri tipi di cellule presenti nel coroide e perché la maggior parte della CE utilizzata in questi saggi non ha origine dalla coroide. Gli EC coroidiali del topo sono difficili da isolare e mantenere in coltura.
Il saggio dell’anello aortico è ampiamente usato come modello di proliferazione macrovascolare. I germogli vascolari provenienti da espianto aortico includono ESC, periciti e macrofagi11. Il saggio dell’anello aortico modella bene l’angiogenesi del vasodi grandi dimensioni 12,13,14. Tuttavia, ha dei limiti come modello di neovascolarizzazione coroidea in quanto gli anelli aortici sono un tessuto macrovascolare privo del caratteristico ambiente microvascolare coroiroidale, e i germogli di grandi vasi possono differire dai germogli dalle reti capillari coinvolte nella patologia microvascolare. Recentemente un gruppo ha pubblicato un saggio retinale ex vivo15,16. Sebbene sia adatto per la malattia neovascolare retinica, non è appropriato per la neovascolarizzazione coroiolare come si vede nell’AMD.
Il saggio di germinazione coroidea utilizzando RPE del topo, coroide e tessuto sclerale espiantato è stato sviluppato per modellare meglio la CNV. Il tessuto può essere facilmente isolato dagli occhi di topo (o altre specie)17. Questo saggio consente una valutazione riproducibile del potenziale pro e anti-angiogenico dei composti farmacologici e la valutazione del ruolo di percorsi specifici nella neovascolarizzazione coroiroidale utilizzando tessuti di topi geneticamente modificati econtrolli 18. Questo saggio di germinazione coroidea è stato citato in molte pubblicazioni successive9,10,18,19,20. Qui viene dimostrato il metodo coinvolto nell’uso di questo saggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il saggio di germinazione coroidea aiuta la ricerca in AMD neovascolare9,10,18,19,20. Le espianto coroide possono essere isolate dai topi, dai ratti e dagli esseriumani 17,21. L’espianto coroide comprende EC, macrofagi e periciti17. In questo saggio l’interazione tra ec coroidia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato supportato da sovvenzioni della Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), del Boston Children’s Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, della Boston Children’s Hospital Ophthalmology Foundation, del BCH Pilot Award, della BCH Manton Center Fellowship e della Little Giraffe Foundation (ZF), della German Research Foundation (DFG; a BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
Materials
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
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