Summary
Questo protocollo presenta il saggio di germinazione coroide, un modello ex vivo di proliferazione microvascolare. Questo saggio può essere utilizzato per valutare le vie coinvolte nei micro vasi cororoidali proliferano e valutare i trattamenti farmacologici utilizzando tipi selvatici e tessuti di topo geneticamente modificati.
Abstract
L'angiogenesi coroiroidale patologica, una caratteristica saliente della degenerazione maculare legata all'età, porta a compromissione della vista e cecità. I test di proliferazione delle cellule endoteliali (CE) che utilizzano cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC) o EC retiniche primarie isolate sono ampiamente utilizzati modelli in vitro per studiare l'angiogenesi retinica. Tuttavia, isolare le cellule endoteliali retiniche murine pure è tecnicamente impegnativo e gli EC retinali possono avere risposte di proliferazione diverse rispetto alle cellule endoteliali coroidiali e alle diverse interazioni cellula/cellula. È stato sviluppato un saggio di germinazione coroidea ex vivo altamente riproducibile come modello di proliferazione microvascolare coroiroidale. Questo modello include l'interazione tra vascucolatura coroide (EC, macrofagi, periciti) e epitelio pigmentato retinico (RPE). Gli espianto di topo RPE/coroide/sclerale sono isolati e incubati nell'estratto di membrana basale (BME) ridotto dal fattore di crescita (giorno 0). Il mezzo viene cambiato a giorni diversi e la germinazione coroide viene quantificata al giorno 6. Le immagini dei singoli espianto coroide vengono scattate con un microscopio a fase invertita e l'area di germogliazione viene quantificata utilizzando un plug-in macro semi-automatizzato al software ImageJ sviluppato in questo laboratorio. Questo saggio di germinazione coroidea ex vivo riproducibile può essere utilizzato per valutare i composti per il potenziale trattamento e per la ricerca sulle malattie microvascolari per valutare le vie coinvolte nella proliferazione dei micro recipienti coroidiali utilizzando tipi selvatici e tessuti di topo geneticamente modificati.
Introduction
La disregolazione dell'angiogenesi coroiroidale è associata alla degenerazione maculare neovascolare legata all'età (AMD)1. La coroide è un letto microvascolare presente sotto l'epitelio pigmentato retinico (RPE). È stato dimostrato che il flusso sanguigno ridotto nella coroide è associato alla progressione dell'AMD2. L'intricata relazione tra endotelio vascolare, RPE, macrofagi, periciti e altre cellule è responsabile dell'omeostasi del tessuto3,4,5. Pertanto, un microambiente coroideo riproducibile che modella il test è fondamentale per lo studio dell'AMD neovascolare.
I test di angiogenesi ex vivo e le colture cellulari endoteliali in vitro possono integrare gli studi sul comportamento microvascolare in vivo, per testare nuovi farmaci e per studi di patogenesi. Cellule endoteliali come le cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC), le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), il cervello animale primario isolato o gli EC retinali sono spesso utilizzati in studi in vitro per la ricerca sull'angiogenesi oculare6,7,8. Gli HRMEC in particolare sono stati ampiamente utilizzati come modello di neovascolarizzazione coroiroidale in vitro (CNV)9 valutando la proliferazione endoteliale, la migrazione, la formazione tubolare e le perdite vascolari pervalutare gli interventi 6,10. Tuttavia, gli EC in coltura sono limitati come modello di CNV a causa della mancanza di interazioni con altri tipi di cellule presenti nel coroide e perché la maggior parte della CE utilizzata in questi saggi non ha origine dalla coroide. Gli EC coroidiali del topo sono difficili da isolare e mantenere in coltura.
Il saggio dell'anello aortico è ampiamente usato come modello di proliferazione macrovascolare. I germogli vascolari provenienti da espianto aortico includono ESC, periciti e macrofagi11. Il saggio dell'anello aortico modella bene l'angiogenesi del vasodi grandi dimensioni 12,13,14. Tuttavia, ha dei limiti come modello di neovascolarizzazione coroidea in quanto gli anelli aortici sono un tessuto macrovascolare privo del caratteristico ambiente microvascolare coroiroidale, e i germogli di grandi vasi possono differire dai germogli dalle reti capillari coinvolte nella patologia microvascolare. Recentemente un gruppo ha pubblicato un saggio retinale ex vivo15,16. Sebbene sia adatto per la malattia neovascolare retinica, non è appropriato per la neovascolarizzazione coroiolare come si vede nell'AMD.
Il saggio di germinazione coroidea utilizzando RPE del topo, coroide e tessuto sclerale espiantato è stato sviluppato per modellare meglio la CNV. Il tessuto può essere facilmente isolato dagli occhi di topo (o altre specie)17. Questo saggio consente una valutazione riproducibile del potenziale pro e anti-angiogenico dei composti farmacologici e la valutazione del ruolo di percorsi specifici nella neovascolarizzazione coroiroidale utilizzando tessuti di topi geneticamente modificati econtrolli 18. Questo saggio di germinazione coroidea è stato citato in molte pubblicazioni successive9,10,18,19,20. Qui viene dimostrato il metodo coinvolto nell'uso di questo saggio.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Boston Children's Hospital (protocollo ARCH numero 19-04-3913R).
1. Preparazione
- Aggiungere 5 mL di penicillina/streptomicina (10000 U/mL) e 5 mL e 10 mL di integratori disponibili in commercio a 500 mL di mezzo classico completo con siero. Aliquota 50 mL del mezzo inizialmente.
NOTA: Non restituire alcun mezzo al magazzino per evitare contaminazioni. - Metti un'aliquota di mezzo classico completo sul ghiaccio.
- Utilizzare il 70% di etanolo per pulire il microscopio sezionato, le forcep e le forbici.
- Preparare due piatti di coltura cellulare (10 cm), uno al microscopio a dissezione, uno sul ghiaccio; mettere 10 mL di mezzo classico completo in ogni piatto.
2. Fasi sperimentali(figura 1)
- Sacrificare topi C57BL/6J intorno al postnatale (P) 20 usando 75-100 mg/kg di chetamina e 7,5-10 mg/kg di xiazina iniettata per via intraperitoneale. Tieni gli occhi in completo mezzo classico sul ghiaccio prima della dissezione.
- Rimuovere il tessuto connettivo (muscolo e tessuto adiposo) e il nervo ottico sull'occhio.
- Utilizzare una microforbice per tagliare circonferenzialmente 0,5 mm posteriore al limbo corneale. Rimuovere il complesso cornea/iris, vitreo e l'obiettivo.
- Rendere un'incisione di 1 mm perpendicolare al bordo tagliato verso il nervo ottico e tagliare una banda circonferenziale di 1 mm di larghezza. Separare le regioni centrali e periferiche del complesso. Utilizzare le forcep per staccare la retina dal complesso RPE/coroide/sclera.
- Mantenere la fascia coroide periferica in un mezzo classico completo sul ghiaccio; isolare l'altro occhio e ripetere il processo per tagliare una seconda fascia.
- Tagliare la banda circolare in 6 ~pezzi quadrati uguali (~1 mm x 1 mm).
NOTA: non toccare mai alcun bordo. - Scongelare l'estratto di membrana basale (BME) per istruzione della fabbricazione. Aggiungere 30 μL/pozzo di BME al centro di ogni pozzo di una piastra di coltura tissutale di 24 pozzo. Assicurarsi che la goccia di BME formi una cupola convessa nella parte inferiore della piastra senza toccare i bordi.
NOTA: Scongelare il BME durante la notte in frigorifero. La BME deve essere sul ghiaccio in qualsiasi momento dopo lo scongelamento. - Posizionare il tessuto al centro del BME.
NOTA: Non appiattire l'espianto coroide; generalmente, lasciare che il tessuto si espanda all'interno del BME. L'orientamento del tessuto (lato sclerale verso l'alto o verso il basso) non ha un impatto sul risultato sperimentale. - Incubare la piastra a 37 °C per 10 minuti per lasciare solidificare il gel.
- Aggiungere 500 μL del mezzo/pozzo classico completo.
- Cambia il mezzo classico a giorni diversi (500 μL). La germinazione coroide può essere osservata dopo 3 giorni con un microscopio.
NOTA: Per il trattamento del fattore di crescita, morire di fame nel tessuto per 4 ore. Diluire un composto di prova nel mezzo ridotto dal fattore di crescita (aumento 1:200 invece di 1:50).
3.SWIFT di quantificazione computerizzata a coroide17 (Figura 2)
NOTA: È stato utilizzato un metodo informatizzato per misurare la superficie coperta dai pescherecci in crescita. È necessario un plug-in macro per il software ImageJ prima della quantificazione (per ulteriori dettagli, vedere Informazioni supplementari).
- Aprite l'immagine che germoglia coroide con ImageJ e controllate "Image | Tipo| 8 bit" con scala di grigi.
- Vai a "Image | Regolare | Luminosità/Contrasto (CTRL/MAIUSC/C)" e ottimizzare il contrasto.
- Utilizzare la funzione bacchetta magica per delineare e rimuovere dall'immagine il tessuto coroideo presente al centro dei germogli (usando il tasto di scelta rapida "F1") (Figura 2A,B).
NOTA: Imposta il tasso di tolleranza della bacchetta magica sul 20-30%. - Rimuovere lo sfondo dell'immagine con gli strumenti di selezione gratuiti (Figura 2C). Vai a "Image | Regolare | Soglia (CTRL/MAIUSC/T)". Utilizzare la funzione soglia per definire i germogli microvascolari sullo sfondo e sulla periferia (Figura 2D).
- Fare clic su "F2" e verrà visualizzato un riepilogo. Salvare un'immagine dell'area selezionata facendo clic su "Salva". Salvare nella stessa cartella dell'immagine originale per riferimento futuro.
- Dopo aver misurato un gruppo di campioni, copiare il registrato per l'analisi dei dati.
NOTA: È anche possibile misurare l'area (μm²) da "Analizza | Set Scale" utilizzando immagini con barre di scala.
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Representative Results
Confronto della crescita della germogliazione coroide al giorno
Abbiamo sezionato la coroide con sclera, incorporata nel BME e coltivata per 6 giorni(Figura 1). La coroide che germoglia nei topi C57BL/6J dal giorno 3 al giorno 6 è stata esaminata con un microscopio e quantificata con SWIFT-Choroid un metodo di quantificazione semi-automatizzato in ImageJ. In un caso rappresentativo, la superficie di germogliazione coroioidea (i recipienti che si estendono dall'espianto, escluso l'espianto stesso) era di 0,38 mm2 al giorno 3 (figura3A),1,47 mm2 al giorno 4(figura 3B),5,62 mm2 al giorno 5(figura 3C)e 10,09 mm2 al giorno 6(figura 3D).
Il recettore libero degli acidi grassi (FFAR)4 la soppressione esacerba la neovascolarizzazione coroiroidale ex vivo.
Gli effetti della perdita di FFAR4 (noto anche come recettore accoppiato G-proteina 120) sulla germinazione vascolare coroidea sono stati valutati utilizzando il saggio di germinazione coroide18. Il complesso coroide, RPE e sclera sono stati sezionati da topi knock out Ffar4 (-/-) e Ffar4+/+ e coltivati come descritto sopra. L'area di germogliazione in Ffar4-/- ha aumentato la crescita vascolare coroiolare rispetto a Ffar4+/+ al giorno 6 (p = 0,004) (Figura 4A,B). Il trattamento dell'agonista FFAR4 (1 μM) ha ridotto l'area di germogliazione coroionale rispetto ai topi non trattati al giorno 6 (p = 0,03)(Figura 4C,D).
Figura 1: Illustrazione schematica che mostra il saggio di germinazione coroide.
Gli occhi furono prima enucleati e tagliati circonferenzialmente circa 0,5 mm posteriori al limbo. La cornea, l'iride, la lente e il vitreo sono stati rimossi. Poi è stato fatto un taglio di 1 mm dal bordo della tazza dell'occhio verso il nervo ottico. Una banda è stata quindi tagliata circonferenzialmente circa 1,0 mm posteriore al bordo tagliato e la banda e le regioni periferiche del complesso sono state separate. La banda è stata tagliata in pezzi di circa 1 mm x 1 mm e incorporata in BME. Poi, usando un microscopio, sono stati visualizzati i germogli microvascolari della coroide. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Metodo di quantificazione computerizzato SWIFT-Choroid.
(A,B) La funzione bacchetta magica è stata utilizzata per delineare il tessuto coroide (freccia bianca) al centro dei germogli ed è stata rimossa digitalmente (tasto di scelta rapida "F1"). (C, D) Lo sfondo dell'immagine è stato rimosso con gli strumenti di selezione gratuiti (freccia nera). I germogli microvascolari sono stati quindi definiti utilizzando la funzione di soglia sullo sfondo e sulla periferia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Germogliare coroide periferica del mouse.
(A-D) Immagini rappresentative di germogli coroidi con un mouse C57BL/6J e dimostrazioni del metodo SWIFT-Choroid che quantificano l'area dei germogli. L'area di germogliazione coroidea era di 0,38 mm2 al giorno 3 (A), 1,47 mm2 al giorno 4 (B), 5,62 mm2 al giorno 5 (C) e 10,09 mm2 al giorno 6(D). Barra di scala; 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il recettore libero degli acidi grassi (FFAR) 4 la soppressione esacerba la neovascolarizzazione coroiroidale.
(A) Immagini rappresentative del saggio di germinazione con coroide del recettore libero degli acidi grassi(Ffar)4+/+ rispetto ai topi knock out Ffar4 (-/-):: l'immagine superiore mostra la coroide di Ffar4+/+ mentre l'immagine inferiore mostra Ffar4-/- coroide. (B)Ffar4-/- ha mostrato un aumento della germinazione coroide rispetto ai topi Ffar4 +/+ (n = 6-8). (C) Immagini rappresentative della germinazione coroide: l'immagine superiore dimostra il trattamento del veicolo (controllo); l'immagine inferiore dimostra il trattamento agonista FFAR4. (D) FFAR4 agonista soppresse la germinazione coroidea rispetto al controllo (n = 10-12). Barre di scala = 500 μm. I dati sono stati analizzati dal t-test dello Studente e sono stati espressi come ± SE. *p < 0,05; **p < 0,01. Questa cifra è stata modificata da Tomita etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Come creare plugin e scorciatoie per il programma di test di germinazione coroide. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il saggio di germinazione coroidea aiuta la ricerca in AMD neovascolare9,10,18,19,20. Le espianto coroide possono essere isolate dai topi, dai ratti e dagli esseriumani 17,21. L'espianto coroide comprende EC, macrofagi e periciti17. In questo saggio l'interazione tra ec coroidiali e cellule adiacenti come le cellule RPE, aiuta ad chiarire i meccanismi coinvolti nella crescita vascolare coroiolare17. Inoltre, questo metodo di valutazione riproducibile e semi-automatizzato riduce la variabilità interobserver17.
Il primo studio pubblicato sul tessuto coroideo ex vivo ha utilizzato coroide isolata per testare interventi farmacologici con il potenziale di trattamento di DR e AMD22,23,24,25. Il saggio ha contato il numero e la lunghezza dei vasi di germogliamento, che possono essere soggetti alla variabilità interobserver. Per contro, il metodo di quantificazione qui descritto è stato standardizzato17. Questo dosaggio di angiogenesi coroide microvascolare include cellule partner interattive e matrice extracellulare. Gli EC in coltura possono perdere molte delle loro proprietà fisiologiche, come la capacità di formare tubivascolari 26 che possono essere dovuti alla perdita di interazione con altre cellule come rpe. Pertanto, le colture ec in vitro potrebbero non riflettere tutti gli aspetti della neovascolarizzazione coroiolica. Il saggio dell'anello aortico include celle endoteliali di grandi vasi e celle interattive per valutare la germogliazione da grandi vasi. Ma i germogli di grandi vasi potrebbero non riflettere accuratamente la malattia microvascolare coroiroidale27. Il saggio di germinazione coroidea è una rappresentazione più stretta delle risposte microvascolari cororoidali.
Ci sono avvertimenti importanti. In primo luogo, i germogli di espianto complessi coroidi periferici sono più coerenti e crescono molto più velocemente degli espianto dalle sezionicentrali 17. In secondo luogo, l'RPE dalla coroide non è stato rimosso perché i germogli coroidi con RPE crescono molto più velocemente che senza RPE17. Per comprendere l'impatto di un farmaco solo sulla coroide, può essere usato il saggio senza RPE. Infine, quando si delinea l'immagine del tessuto coroide e dell'area di germogliatura utilizzando la funzione bacchetta magica, a volte è difficile rintracciare l'area della coroide che germoglia a causa dell'elevato rumore di fondo. Ci possono essere variazioni tra le immagini. Pertanto, per coerenza, è importante creare digitalmente un contrasto sufficiente tra coroide e sfondo, come si vede nella figura 2.
In sintesi, il saggio di germinazione coroide ex vivo è stato caratterizzato e semi-automatizzato. Questo metodo fornisce uno strumento sperimentale per la ricerca AMD. Questo saggio può essere utilizzato per migliorare i composti come potenziali trattamenti o per valutare le vie coinvolte nella proliferazione di micro vasi coroidiali che utilizzano tipi selvatici e tessuto di topo geneticamente modificato.
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Disclosures
Gli autori non hanno informazioni finanziarie. Il metodo informatizzato è disponibile gratuitamente per gli istituti accademici attraverso gli autori.
Acknowledgments
Il lavoro è stato supportato da sovvenzioni della Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), del Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, della Boston Children's Hospital Ophthalmology Foundation, del BCH Pilot Award, della BCH Manton Center Fellowship e della Little Giraffe Foundation (ZF), della German Research Foundation (DFG; a BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
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