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Biology

Ein Ex Vivo Choroid Sprouting Assay der ocular Microvascular Angiogenese

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61677
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 1
1Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Clinical and Metabolic Genetics, Hospital for Sick Children, University of Toronto, 3Manton Center for Orphan Disease, Harvard Medical School, Boston Children's Hospital

Summary

Dieses Protokoll stellt einen Aderhautkeim-Assay dar, ein Ex-vivo-Modell der mikrovaskulären Proliferation. Dieser Test kann verwendet werden, um Wege zu bewerten, die an sich vermehrenden aderatorischen Mikrogefäßen beteiligt sind, und medikamentöse Behandlungen mit Wildtyp und genetisch verändertem Mausgewebe zu bewerten.

Abstract

Die pathologische Aderhautangiogenese, ein markantes Merkmal der altersbedingten Makuladegeneration, führt zu Sehstörungen und Erblindung. Endotheliale Zell(E-Zell-Assays mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HRMECs) oder isolierten primären retinalen ECs sind weit verbreitet in vitro-Modelle zur Untersuchung der retinalen Angiogenese. Die Isolierung reiner muriner retinaler Endothelzellen ist jedoch technisch anspruchsvoll und netzhautförmige ECs können andere Proliferationsreaktionen haben als aderhautförmige Endothelzellen und verschiedene Zell-/Zell-Wechselwirkungen. Es wurde ein hochreproduzierbarer ex vivo aderhautspessender Assay als Modell der choroidalen mikrovaskulären Proliferation entwickelt. Dieses Modell umfasst die Wechselwirkung zwischen Derhautvaskulatur (EC, Makrophagen, Pericyten) und retinalem Pigmentepithel (RPE). Maus-RPE/Choroid/Skleralexplanten werden isoliert und in wachstumsfaktorreduziertem Basalmembranextrakt (BME) (Tag 0) inkubiert. Medium wird jeden zweiten Tag verändert und Die Aderhautsprossen wird an Tag 6 quantifiziert. Die Bilder einzelner Aderhautexplantationen werden mit einem invertierten Phasenmikroskop aufgenommen und der Keimbereich wird mit einem halbautomatischen Makro-Plug-in zur in diesem Labor entwickelten ImageJ-Software quantifiziert. Dieser reproduzierbare Ex-vivo-Chorsponnen-Sprossen-Assay kann verwendet werden, um Verbindungen für eine mögliche Behandlung und für die Forschung an mikrovaskulären Erkrankungen zu bewerten, um Wege zu bewerten, die an der Verbreitung von Aderhautmikrogefäßen mit Wildtyp und genetisch verändertem Mausgewebe beteiligt sind.

Introduction

Die Dysregulation der Choroidalangiogenese ist mit der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD)1verbunden. Die Aderhaut ist ein mikrovaskuläres Bett unter dem retinalen Pigmentepithel (RPE). Es hat sich gezeigt, dass ein reduzierter Blutfluss in der Aderhaut mit der Progression von AMD2verbunden ist. Die komplizierte Beziehung zwischen vaskulärem Endothel, RPE, Makrophagen, Pericyten und anderen Zellen ist verantwortlich für die Homöostase des Gewebes3,4,5. Daher ist eine reproduzierbare Assaymodellierung der aderatorischen Mikroumgebung für die Untersuchung der neovaskulären AMD von entscheidender Bedeutung.

Ex-vivo-Angiogenese-Assays und in vitro endotheliale Zellkulturen können Studien über mikrovaskuläres Verhalten in vivo, zur Erprobung neuer Medikamente und für Studien zur Pathogenese ergänzen. Endothelzellen wie menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen (HRMECs), Human Umbilical Venin Endothelial Cells (HUVEC), isolierte primäre tierische Gehirne oder netzretinale ECs werden häufig in In-vitro-Studien zur okulären Angiogeneseforschung6,7,8verwendet. Insbesondere HRMECs wurden weithin als Modell der in vitro choroidalen Neovaskularisation (CNV)9 verwendet, indem die endotheliale Proliferation, Migration, tubuläre Bildung und vaskuläre Leckage bewertet wurden, um die Interventionen6,10zu bewerten. Jedoch, ECs in der Kultur sind als Modell der CNV begrenzt, weil es an Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen in der Aderhaut gefunden und weil die meisten EC in diesen Assays verwendet stammen nicht von Derader. Maus-Aderhaut-ECs sind in der Kultur schwer zu isolieren und zu pflegen.

Der Aortenring-Assay wird weithin als Modell der makrovaskulären Proliferation verwendet. Zu den Gefäßsprossen von Aortenexpflanzen gehören ECs, Pericyte und Makrophagen11. Der Aortenring-Assay modelliert große Gefäßangiogenese gut12,13,14. Es hat jedoch Einschränkungen als Modell der choroidalen Neovaskularisation, da Aortenringe ein makrovaskuläres Gewebe sind, das nicht die charakteristische choroidale mikrovaskuläre Umgebung aufweist, und Sprossen aus großen Gefäßen können sich von Sprossen aus Kapillarnetzwerken unterscheiden, die an mikrovaskulärer Pathologie beteiligt sind. Kürzlich veröffentlichte eine Gruppe einen Ex-vivo-Retina-Assay15,16. Obwohl, Es ist geeignet für retinale neovaskuläre Erkrankungen, Es ist nicht so geeignet für choroidale Neovaskularisation wie bei AMD gesehen.

Der aderodiensprosende Assay mit Maus-RPE, Aderhaut und skleral explantiertem Gewebe wurde entwickelt, um CNV besser zu modellieren. Das Gewebe kann leicht von Maus (oder anderen Arten) Augen isoliert werden17. Dieser Test ermöglicht eine reproduzierbare Bewertung des pro- und antiangiogenetischen Potenzials von pharmakologischen Verbindungen und die Bewertung der Rolle spezifischer Wege bei der choroidalen Neovaskularisation mit Gewebe von genetisch veränderten Mäusen und Kontrollen18. Dieser aderhautspaltnde Assay wurde in vielen nachfolgenden Publikationen9,10,18,19,20erwähnt. Hier wird die Methode demonstriert, die bei der Verwendung dieses Assays zum Einsatz kommt.

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Protocol

Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Boston Children es Hospital genehmigt (ARCH-ProtokollNummer 19-04-3913R).

1. Vorbereitung

  1. Fügen Sie 5 ml Penicillin/Streptomycin (10000 U/ml) und 5 ml handelsübliche Ergänzungen zu 500 ml komplettem klassischen Medium mit Serum hinzu. Aliquot 50 ml des Mediums zunächst.
    HINWEIS: Geben Sie kein Medium zurück an den Bestand, um eine Kontamination zu vermeiden.
  2. Setzen Sie ein Aliquot von kompletten klassischen Medium auf Eis.
  3. Verwenden Sie 70% Ethanol, um das Sezieren von Mikroskop, Zange und Schere zu reinigen.
  4. Bereiten Sie zwei Zellkultur-Gerichte (10 cm), eine auf dem Seziermikroskop, eine auf Eis; 10 ml komplettes klassisches Medium in jedes Gericht geben.

2. Experimentelle Schritte (Abbildung 1)

  1. Opfern Sie C57BL/6J-Mäuse um postnatale (P) 20 mit 75-100 mg/kg Ketamin und 7,5 -10 mg/kg Xylazin intraperitoneal injiziert. Halten Sie die Augen in komplettem klassischen Medium auf Eis vor der Zerlegung.
  2. Entfernen Sie das Bindegewebe (Muskel- und Fettgewebe) und den Sehnerv auf dem Auge.
  3. Verwenden Sie eine Mikroschere, um 0,5 mm nach dem Hinterteil des Hornhaut-Limbus umlaufen zu lassen. Entfernen Sie den Hornhaut-Iris-Komplex, Glaskörper und die Linse.
  4. Machen Sie einen 1 mm Schnitt senkrecht zur Schnittkante zum Sehnerv und schneiden Sie ein Umfangsband von 1 mm Breite. Trennen Sie die zentralen und peripheren Regionen des Komplexes. Verwenden Sie Zangen, um die Netzhaut aus dem RPE/Choroid/Sklera-Komplex abzuziehen.
  5. Halten Sie das periphere Aderhautband in komplettem klassischen Medium auf Eis; isolieren Sie das andere Auge und wiederholen Sie den Vorgang, um ein zweites Band zu schneiden.
  6. Schneiden Sie das Kreisförmige Band in 6 ,gleich quadratische Stücke (ca. 1 mm x 1 mm).
    HINWEIS: Berühren Sie niemals eine Kante.
  7. Den Basalmembranextrakt (BME) pro Herstelleranweisung auftauen. Fügen Sie 30 L/Well von BME in die Mitte jedes Brunnens einer 24 Brunnen-Gewebekulturplatte hinzu. Stellen Sie sicher, dass das Tröpfchen von BME eine konvexe Kuppel an der Unterseite der Platte bildet, ohne die Kanten zu berühren.
    HINWEIS: Das BME über Nacht im Kühlschrank auftauen. BME sollte jederzeit nach dem Auftauen auf dem Eis sein.
  8. Legen Sie das Gewebe in die Mitte des BME.
    HINWEIS: Die Aderhautexplantation nicht abflachen; lassen Sie das Gewebe im Allgemeinen innerhalb des BME ausdehnen. Die Ausrichtung des Gewebes (Skleralseite nach oben oder unten) hat keinen Einfluss auf das experimentelle Ergebnis.
  9. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 10 min, um das Gel erstarren zu lassen.
  10. Fügen Sie 500 l des kompletten klassischen Mediums/Well hinzu.
  11. Ändern Sie das klassische Medium jeden zweiten Tag (500 l). Das Choroid-Sprießen kann nach 3 Tagen mit einem Mikroskop beobachtet werden.
    HINWEIS: Für die Behandlung des Wachstumsfaktors verhungern Sie das Gewebe für 4 h. Verdünnen Sie eine Versuchsverbindung in wachstumsfaktorreduzierten Medien (1:200 Boost statt 1:50).

3.SWIFT-Choroid computerisierteQuantifizierungsmethode 17 (Abbildung 2)

HINWEIS: Es wurde eine computergestützte Methode zur Messung der Fläche verwendet, die von wachsenden Schiffen bedeckt ist. Vor der Quantifizierung wird ein Makro-Plugin zur ImageJ-Software benötigt (weitere Informationen finden Sie unter Ergänzende Informationen).

  1. Öffnen Sie das Aderhaut-Sprossenbild mit ImageJ und aktivieren Sie "Bild | Typ| 8-Bit" mit Graustufen.
  2. Gehe zu "Image | Anpassen | Helligkeit/Kontrast (Strg/Shift/C)" und optimieren Sie den Kontrast.
  3. Verwenden Sie die Zauberstab-Funktion, um das Aderhautgewebe, das in der Mitte der Sprossen vorhanden ist, umzureißen und aus dem Bild zu entfernen (mit Tastenkombination "F1") (Abbildung 2A,B).
    HINWEIS: Legen Sie die Toleranzrate des Zauberstabs auf 20-30% fest.
  4. Entfernen Sie den Hintergrund des Bildes mit den kostenlosen Auswahlwerkzeugen (Abbildung 2C). Gehe zu "Image | Anpassen | Schwellenwert (Strg/Shift/T)". Verwenden Sie die Schwellenfunktion, um die mikrovaskulären Sprossen vor dem Hintergrund und der Peripherie zu definieren (Abbildung 2D).
  5. Klicken Sie auf "F2" und es wird eine Zusammenfassung angezeigt. Speichern Sie ein Bild des ausgewählten Bereichs, indem Sie auf"Speichern"klicken. Speichern Sie im selben Ordner wie das Originalbild für zukünftige Referenzen.
  6. Nachdem eine Gruppe von Stichproben gemessen wurde, kopieren Sie die aufgezeichneten für die Datenanalyse.
    ANMERKUNG: Es ist auch möglich, die Fläche (m2) mit"Analysieren | Set Scale" mit Bildern mit Maßstabsleisten.

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Representative Results

Vergleich des Aderhautsprießens pro Tag

Wir sezierten die Aderhaut mit Sklera, eingebettet in BME und kultivierten sie für 6 Tage (Abbildung 1). Die Aderhautsprossen in C57BL/6J-Mäusen vom 3. bis 6. Tag wurden mit einem Mikroskop untersucht und mit SWIFT-Choroid, einer halbautomatischen Quantifizierungsmethode in ImageJ, quantifiziert. In einem repräsentativen Fall betrug der Aderhautsprossenbereich (die Gefäße, die sich von der Expflanze aus ausdehnen, mit Ausnahme der Explantation selbst) 0,38 mm2 an Tag 3 (Abbildung 3A), 1,47 mm2 an Tag 4 (Abbildung 3B), 5,62 mm2 an Tag 5 (Abbildung 3C) und 10,09 mm2 an Tag 6 (Abbildung 3D).

Freier Fettsäurerezeptor (FFAR)4-Unterdrückung verschärft die choroidale Neovaskularisation ex vivo.

Die Auswirkungen des Verlustes von FFAR4 (auch bekannt als G-Protein gekoppelter Rezeptor 120) auf die aderotodale Gefäßkeimung wurden mit dem Aderhautkeimen18ausgewertet. Der Aderhaut-, RPE- und Sklera-Komplex wurden von Ffar4-Knock-out -(-/-) und Ffar4+/+ Mäusen seziert und wie oben beschrieben kultiviert. Der Keimbereich in Ffar4-/- erhöhtes choroidales Gefäßwachstum im Vergleich zu Ffar4+/+ an Tag 6 (p = 0,004) (Abbildung 4A,B). Die Behandlung des FFAR4-Agonisten (1 M) reduzierte den aderhautförmigen Sprossenbereich im Vergleich zu unbehandelten Mäusen an Tag 6 (p = 0,03) (Abbildung 4C,D).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Abbildung mit Aderhautsprouting-Assay.
Die Augen wurden zuerst enukleiert und umkreisend etwa 0,5 mm hinter dem Limbus geschnitten. Die Hornhaut, Iris, Linse und Glaskörper wurden entfernt. Dann wurde ein 1 mm Schnitt vom Rand des Augenbechers in Richtung des Sehnervs gemacht. Ein Band wurde dann um1,0 mm nach der Schnittkante umkreisend geschnitten und das Band und die Randbereiche des Komplexes getrennt. Das Band wurde in ca. 1 mm x 1 mm Stücke geschnitten und in BME eingebettet. Anschließend wurden mit Hilfe eines Mikroskops die mikrovaskulären Sprossen aus der Aderhaut visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: COMPUTERgestützte Quantifizierungsmethode SWIFT-Choroid.
(A,B) Zauberstab-Funktion wurde verwendet, um das Aderhautgewebe (weißer Pfeil) in der Mitte der Sprossen zu skizzieren und es wurde digital entfernt (Shortcut-Taste "F1"). (C, D) Der Hintergrund des Bildes wurde mit den freien Auswahlwerkzeugen (schwarzer Pfeil) entfernt. Mikrovaskuläre Sprossen wurden dann mit der Schwellenfunktion vor dem Hintergrund und der Peripherie definiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Maus-Peripherieadersprossen.
(A-D) Repräsentative Bilder von Adersprossen mit einer C57BL/6J-Maus und Vorführungen der SWIFT-Choroid-Methode zur Quantifizierung des Sprossenbereichs. Die Aderhautsprossenfläche betrug 0,38 mm2 an Tag 3 (A), 1,47 mm2 an Tag 4 (B), 5,62 mm2 an Tag 5 (C) und 10,09 mm2 an Tag 6 (D). Skalenbalken; 500 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Freier Fettsäurerezeptor (FFAR) 4 Unterdrückung verschlimmern choroidale Neovaskularisation.
(A) Repräsentative Bilder des keimenden Assays mit Aderhaut aus dem Freien Fettsäurerezeptor (Ffar)4+/+ im Vergleich zu Ffar4-Knock-out (-/-) Mäusen: Oberbild zeigt die Aderhaut von Ffar4+/+ während das untere Bild Ffar4-/- Aderhaut zeigt. (B)Ffar4-/- zeigte eine erhöhte Aderhautsprossenung im Vergleich zu Ffar4 +/+ Mäusen (n = 6-8). (C) Repräsentative Bilder des Aderhautkeimens: Oberbild zeigt Fahrzeugbehandlung (Kontrolle); unteres Bild zeigt die Behandlung von FFAR4-Agonisten. (D) FFAR4-Agonist unterdrückte Aderhautsprossen im Vergleich zur Kontrolle (n = 10–12). Skalenbalken = 500 m. Die Daten wurden durch den T-Test des Studenten analysiert und als Mittelwert ± SE ausgedrückt. *p < 0,05; **p < 0,01. Diese Zahl wurde von Tomita et al.18geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Wie man Plugins und Verknüpfungen für die Aderhaut sprouting Assay-Programm zu erstellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Der choroidal sprossende Assay unterstützt die Forschung in neovaskulären AMD9,10,18,19,20. Aderhautexplantationen können sowohl von Mäusen als auch von Ratten und Menschen isoliert werden17,21. Die Aderhautexplantation umfasst ECs, Makrophagen und Pericyten17. In diesem Test hilft die Wechselwirkung zwischen aderhautförmigen ECs und benachbarten Zellen wie RPE-Zellen, die Mechanismen des choroidalen Gefäßwachstumsaufzuklären 17. Darüber hinaus verringert diese reproduzierbare und halbautomatische Bewertungsmethode die Interobserver-Variabilität17.

Die erste veröffentlichte Studie von ex vivo Aderhautgewebe verwendet isolierte Aderhaut, um pharmakologische Interventionen mit dem Potenzial zur Behandlung von DR und AMD22,23,24,25zu testen. Der Test zählte die Anzahl und Länge der keimenden Gefäße, die einer Interobserver-Variabilität unterliegen können. Im Gegensatz dazu wurde die hier beschriebene Quantifizierungsmethode standardisiert17. Dieser Assay der mikrovaskulären Aderoid-Angiogenese umfasst interaktive Partnerzellen und extrazelluläre Matrix. ECs in der Kultur können viele ihrer physiologischen Eigenschaften verlieren, wie die Fähigkeit, Gefäßröhren26 zu bilden, was auf den Verlust der Interaktion mit anderen Zellen wie RPE zurückzuführen sein kann. Daher spiegeln EC-In-vitro-Kulturen möglicherweise nicht alle Aspekte der choroidalen Neovaskularisation wider. Der Aortenring-Assay umfasst große Gefäßendothelzellen und interaktive Zellen, um das Keimen aus großen Gefäßen zu bewerten. Aber große Gefäßsprossen können choroidale mikrovaskuläre Erkrankungen nicht genau reflektieren27. Der choroidal sprossende Assay ist eine engere Darstellung der choroidalen mikrovaskulären Reaktionen.

Es gibt wichtige Vorbehalte. Erstens sind die peripheren Aderhautkomplex-Explantationssprossen konsistenter und wachsen viel schneller als Expflanzen aus den zentralen Abschnitten17. Zweitens wurde der RPE aus der Aderhaut nicht entfernt, da Aderhautsprossen mit RPE viel schneller wachsen als ohne RPE17. Um die Auswirkungen eines Medikaments auf die Aderhaut allein zu verstehen, kann der Assay ohne RPE verwendet werden. Schließlich, wenn das Bild von Aderhautgewebe und Keimbereich mit der Zauberstab-Funktion skizziert, ist es manchmal schwierig, den Bereich der Aderhaut sprießend wegen hoher Hintergrundgeräusche zu verfolgen. Es kann Unterschiede zwischen den Bildern geben. Daher ist es für konsistenzlich wichtig, einen ausreichenden Kontrast zwischen Aderhaut und Hintergrund digital zu erzeugen, wie in Abbildung 2dargestellt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Ex-vivo-Adersprossen-Assay charakterisiert und halbautomatisiert wurde. Diese Methode stellt ein experimentelles Werkzeug für die AMD-Forschung bereit. Dieser Test kann verwendet werden, um Verbindungen als mögliche Behandlungen zu überprüfen oder Wege zu bewerten, die an sich vermehrenden aderatorischen Mikrogefäßen mit Wildtyp und genetisch verändertem Mausgewebe beteiligt sind.

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Disclosures

Die Autoren haben keine finanziellen Angaben. Die computergestützte Methode steht akademischen Einrichtungen über die Autoren kostenlos zur Verfügung.

Acknowledgments

Die Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children es Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children es Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship, und Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; to BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AnaSed (Xylazine) AKORN 59339-110-20
Basal membrane extract (BME) Matrigel BD Biosciences 354230
Cell culture dish NEST 704001 10cm
Complete classic medium with serum and CultureBoost Cell systems 4Z0-500
Ethyl alcohol 200 Proof Pharmco 111000200 use for 70%
Kimwipes Kimberly-Clark 06-666
Microscope ZEISS Axio Observer Z1
Penicillin/Streptomycin GIBCO 15140 10000 U/mL
Tissue culture plate (24-well) Olympus 25-107
VetaKet CIII (Ketamine) AKORN 59399-114-10

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References

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Tomita, Y., Shao, Z., Cakir, B., Kotoda, Y., Fu, Z., Smith, L. E. H. An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis. J. Vis. Exp. (162), e61677, doi:10.3791/61677 (2020).

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