Summary
यह प्रोटोकॉल कोरॉयड अंकुरण परख प्रस्तुत करता है, जो माइक्रोवैस्कुलर प्रसार का एक पूर्व वीवो मॉडल है। इस परख का उपयोग कोरोइडल माइक्रो जहाजों के प्रसार में शामिल रास्तों का आकलन करने और जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस ऊतक का उपयोग करके दवा उपचार का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
पैथोलॉजिकल कोरॉयड एंजियोजेनेसिस, उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन की एक प्रमुख विशेषता, दृष्टि हानि और अंधापन की ओर जाता है। एंडोथेलियल सेल (ईसी) प्रसार परिध मानव रेटिना माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचआरएमईसी) या अलग प्राथमिक रेटिना ईसी का उपयोग रेटिना एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए विट्रो मॉडल में व्यापक रूप से किया जाता है। हालांकि, शुद्ध मुरीन रेटिना एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और रेटिना एसी में कोरॉयड एंडोथेलियल कोशिकाओं और विभिन्न सेल/सेल इंटरैक्शन की तुलना में अलग-अलग प्रसार प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं। कोरोइडल माइक्रोवैस्कुलर प्रसार के मॉडल के रूप में एक अत्यधिक प्रजनन योग्य पूर्व वीवो कोरो कोरॉइडल अंकुरण परख विकसित की गई थी। इस मॉडल में कोरॉइड वैक्यूलेचर (ईसी, मैक्रोफेज, पेरिसाइट्स) और रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) के बीच बातचीत शामिल है। माउस आरपीई/कोरॉयड/स्क्लेरल एक्सप्लांट्स को विकास-कारक-कम बेसल झिल्ली निकालने (बीएमई) (दिन 0) में अलग-थलग और इनक्यूबेटेड किया जाता है । मध्यम हर दूसरे दिन बदल जाता है और 6 दिन में कोरॉइड अंकुरण की मात्रा निर्धारित की जाती है। व्यक्तिगत कोरॉइड एक्सप्लांट की छवियों को एक उल्टे चरण माइक्रोस्कोप के साथ लिया जाता है और अंकुरण क्षेत्र को इस प्रयोगशाला में विकसित इमेजजे सॉफ्टवेयर में अर्ध-स्वचालित मैक्रो प्लग-इन का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किया जाता है। इस प्रजनन पूर्व वीवो कोरोइडल अंकुरण परख का उपयोग संभावित उपचार के लिए यौगिकों का आकलन करने और सूक्ष्मवहन रोग अनुसंधान के लिए जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस ऊतक का उपयोग करके कोरॉयडल माइक्रो पोत प्रसार में शामिल रास्तों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
कोरॉइडल एंजियोजेनेसिस डिस्रेगुलेशन नियोवैस्कुलर उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन (एएमडी)1से जुड़ा हुआ है। कोरॉयड रेटिना वर्णक एपिथेलियम (आरपीई) के नीचे मौजूद एक माइक्रोवैस्कुलर बिस्तर है। यह दर्शाया गया है कि कोरॉइड में रक्त प्रवाह में कमी एएमडी2की प्रगति से जुड़ी हुई है . संवहनी एंडोथेलियम, आरपीई, मैक्रोफेज, पेरिसाइट्स और अन्य कोशिकाओं के बीच जटिल संबंधऊतक3,4,5के होमोसेस्टेसिस के लिए जिम्मेदार है। इसलिए, नेओवैस्कुलर एएमडी के अध्ययन के लिए एक प्रजनन योग्य परख मॉडलिंग कोरोइडल माइक्रोएनवायरमेंट महत्वपूर्ण है।
पूर्व वीवो एंजियोजेनेसिस परख और इन विट्रो एंडोथेलियल सेल संस्कृतियां वीवो में माइक्रोवैस्कुलर व्यवहार के अध्ययनों को पूरक कर सकती हैं, नई दवाओं के परीक्षण के लिए और रोगजनन के अध्ययन के लिए। एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे मानव रेटिना माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचआरएमईसी), मानव नाभि नस एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचयूवीईसी), अलग प्राथमिक पशु मस्तिष्क या रेटिना एसी का उपयोग अक्सर नेत्र एंजियोजेनेसिसअनुसंधान6, 7,8 के लिए विट्रो अध्ययन में कियाजाताहै। विशेष रूप से एचआरएमईसी को एंडोथेलियल प्रसार, माइग्रेशन, ट्यूबलरगठन और संवहनी रिसाव का आकलन करके इन विट्रो कोरॉइडल नियोवैस्कुलराइजेशन (सीएनवी) 9 के मॉडल के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है ताकि हस्तक्षेप6,10का मूल्यांकन किया जा सके। हालांकि, संस्कृति में ईसी सीएनवी के मॉडल के रूप में सीमित हैं क्योंकि कोरॉइड में पाए जाने वाले अन्य सेल प्रकारों के साथ बातचीत की कमी है और क्योंकि इन परखों में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश ईसी कोरॉइड से उत्पन्न नहीं होते हैं। माउस कोरॉयड ईसीएस को संस्कृति में अलग करना और बनाए रखना मुश्किल है।
महाधमनी अंगूठी परख व्यापक रूप से मैक्रो संवहनी प्रसार के एक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है। महाधमनी एक्सप्लांट से संवहनी अंकुरित में ईसीएस, पेरिसाइट्स और मैक्रोफेज11शामिल हैं। महाधमनी अंगूठी परख बड़े पोत एंजियोजेनेसिस को 12 ,13,14में मॉडल बनाती है । हालांकि, इसकी सीमाएं कोरोइडल नियोवैस्कुलराइजेशन के मॉडल के रूप में हैं क्योंकि महाधमनी छल्ले एक मैक्रोवैस्कुलर ऊतक हैं जिसमें विशेषता कोरॉइडल माइक्रोवैस्कुलर वातावरण की कमी होती है, और बड़े जहाजों से अंकुरित स्प्राउट्स माइक्रोवैस्कुलर पैथोलॉजी में शामिल केशिका नेटवर्क से अंकुरित से भिन्न हो सकते हैं। हाल ही में एक समूह ने एक पूर्व वीवो रेटिना परख15,16प्रकाशित की । हालांकि, यह रेटिना नियोवैस्कुलर रोग के लिए उपयुक्त है, यह एएमडी में देखे गए कोरॉयड नियोवैस्कुलराइजेशन के लिए उतना उपयुक्त नहीं है।
माउस आरपीई, कोरॉयड, और स्क्लेरल एक्सपेल्ड ऊतक का उपयोग करके कोरॉइड स्प्राउटिंग परख को बेहतर मॉडल सीएनवी के लिए विकसित किया गया था। ऊतक आसानी से माउस (या अन्य प्रजातियों) आंखों से अलग किया जा सकता है17। यह परख फार्माकोलॉजिक यौगिकों की प्रो-और एंटी-एंजियोजेनिक क्षमता के प्रजनन योग्य मूल्यांकन और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से ऊतक का उपयोग करके कोरॉइडल नियोवैस्कुलराइजेशन में विशिष्ट रास्तों की भूमिका का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है और18को नियंत्रित करता है। इस कोरॉयड अंकुरण की परख का उल्लेख बाद के कई प्रकाशनों 9 ,10,18,19,20में किया गया है . यहां इस परख के इस्तेमाल में शामिल विधि का प्रदर्शन किया जाता है।
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Protocol
वर्णित सभी पशु प्रयोगों बोस्टन बच्चों के अस्पताल में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (ARCH प्रोटोकॉल संख्या 19-04-3913R) ।
1. तैयारी
- पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (10000 यू/एमएल) के 5 एमएल और 5 एमएल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सप्लीमेंट्स को सीरम के साथ पूर्ण क्लासिक माध्यम के 500 एमएल में जोड़ें। एलिकोट शुरू में माध्यम का 50 एमएल।
नोट: संदूषण से बचने के लिए किसी भी माध्यम को स्टॉक में वापस न करें। - बर्फ पर पूरा क्लासिक माध्यम का एक aliquot रखो ।
- विच्छेदन माइक्रोस्कोप, संदंश और कैंची को साफ करने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें।
- दो सेल संस्कृति व्यंजन (10 सेमी), विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर एक, बर्फ पर एक तैयार करें; प्रत्येक डिश में पूर्ण क्लासिक माध्यम के 10 एमएल डाल दिया।
2. प्रायोगिक कदम(चित्रा 1)
- बलिदान C57BL/6J चूहों के आसपास प्रसवोत्तर (पी) 20 75-100 मिलीग्राम/किलो केटामाइन और ७.५-10 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन का उपयोग कर इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन । विच्छेदन से पहले बर्फ पर पूरी तरह क्लासिक माध्यम में आंखों को रखें।
- कनेक्टिव टिश्यू (मांसपेशी और फैटी टिश्यू) और आंखों पर ऑप्टिक नर्व निकालें।
- कॉर्नियल लिम्बस के पीछे 0.5 मिमी काटने के लिए माइक्रो-कैंची का उपयोग करें। कॉर्निया/आईरिस कॉम्प्लेक्स, विट्रियस और लेंस को हटा दें ।
- ऑप्टिक तंत्रिका की ओर कट किनारे के लिए एक 1 मिमी चीरा लंबवत बनाओ और 1 मिमी चौड़ाई के एक परिधि बैंड में कटौती। परिसर के केंद्रीय और परिधीय क्षेत्रों को अलग करें। आरपीई/कोरॉयड/स्क्लेरा कॉम्प्लेक्स से रेटिना को छीलने के लिए संदंश का प्रयोग करें ।
- बर्फ पर पूर्ण क्लासिक माध्यम में परिधीय कोरॉइड बैंड रखें; दूसरी आंख को अलग करें और दूसरे बैंड को काटने की प्रक्रिया दोहराएं।
- परिपत्र बैंड को 6 ~ बराबर वर्ग टुकड़ों (~ 1 मिमी x 1 मिमी) में काट लें।
नोट: किसी भी किनारे को कभी न छुएं। - निर्माण के निर्देश के अनुसार बेसल झिल्ली निकालने (बीएमई) गल। एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं के केंद्र में बीएमई के 30 μL/well जोड़ें । सुनिश्चित करें कि बीएमई की बूंद किनारों को छूने के बिना प्लेट के नीचे एक उत्तल गुंबद बनाती है।
नोट: एक रेफ्रिजरेटर में रात भर बीएमई गल । बीएमई विगलन के बाद किसी भी समय बर्फ पर होना चाहिए। - टिश्यू को बीएमई के बीच में रखें।
नोट: कोरॉयड एक्सप्लांट को समतल न करें; आम तौर पर, ऊतक को बीएमई के भीतर विस्तार करने दें। ऊतक का अभिविन्यास (ऊपर या नीचे स्क्लैलल साइड) प्रयोगात्मक परिणाम को प्रभावित नहीं करता है। - जेल को जमना करने के लिए 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
- पूरा क्लासिक माध्यम के ५०० μL जोड़ें/
- हर दूसरे दिन क्लासिक माध्यम (500 μL) बदलें। एक माइक्रोस्कोप के साथ 3 दिनों के बाद कोरॉयड अंकुरण देखा जा सकता है।
नोट: विकास कारक उपचार के लिए, 4 घंटे के लिए ऊतक भूखा । विकास कारक में एक परीक्षण यौगिक कम माध्यम (1:200 को बढ़ावा देने के बजाय 1:50) ।
3.SWIFT-कोरॉइड कंप्यूटरीकृत क्वांटिफिकेशन विधि17 (चित्रा 2)
नोट: बढ़ते जहाजों द्वारा कवर किए गए क्षेत्र को मापने के लिए एक कंप्यूटरीकृत विधि का उपयोग किया गया था। क्वांटिफिकेशन से पहले इमेजजे सॉफ्टवेयर के लिए एक मैक्रो प्लगइन की आवश्यकता होती है (आगे विस्तार के लिए पूरक जानकारी देखें)।
- इमेजजे के साथ कोरॉइड स्प्राउटिंग इमेज खोलें और चेक करें"इमेज | टाइप करें| 8-बिट"ग्रे स्केल के साथ।
- " इमेज | पर जाएं | समायोजित करें ब्राइटनेस/कंट्रास्ट (सीटीआरएल/शिफ्ट/सी)" और कंट्रास्ट को अनुकूलित करें ।
- छवि को को कोनॉइड ऊतक से तैयार करने और हटाने के लिए जादू की छड़ी फ़ंक्शन का उपयोग करें जो स्प्राउट्स के केंद्र में मौजूद हैं (शॉर्टकट कुंजी"एफ 1")(चित्र 2ए, बी)का उपयोग करके) ।
नोट: जादू की छड़ी की सहिष्णुता दर 20-30% तक निर्धारित करें। - मुफ्त चयन उपकरण(चित्रा 2C)के साथ छवि की पृष्ठभूमि को हटा दें। " इमेज | पर जाएं | समायोजित करें दहलीज (Ctrl/shift/T)"। पृष्ठभूमि और परिधि(चित्रा 2डी)के खिलाफ माइक्रोवैस्कुलर स्प्राउट्स को परिभाषित करने के लिए दहलीज फ़ंक्शन का उपयोग करें।
- क्लिक करें'F2'और एक सारांश दिखाई देगा। "सेव" पर क्लिक करके चयनित क्षेत्र की एक छविको सहेजें। भविष्य के संदर्भ के लिए मूल छवि के रूप में एक ही फ़ोल्डर में सहेजें।
- नमूनों के एक समूह को मापा जाता है के बाद, डेटा विश्लेषण के लिए दर्ज की गई प्रतिलिपि।
नोट: "विश्लेषण | द्वारा क्षेत्र (μm²) को मापना भी संभवहै स्केलबार के साथ छवियों का उपयोग करके स्केल सेट करें "
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Representative Results
प्रति दिन कोरॉइड अंकुरण वृद्धि की तुलना
हमने बीएमई में एम्बेडेड स्क्लेरा के साथ कोरॉइड को विच्छेदित किया और उन्हें 6 दिनों(चित्रा 1)के लिए सुसंस्कृत किया। 3 से 6 दिन तक C57BL/6J चूहों में कोरॉइड अंकुरण की जांच माइक्रोस्कोप के साथ की गई और स्विफ्ट-कोरॉइड के साथ इमेजजे में अर्ध-स्वचालित मात्राकरण विधि के साथ मात्रा निर्धारित की गई । एक प्रतिनिधि मामले में, कोरोइडल स्प्राउटिंग एरिया (एक्सप्लांट से विस्तारित जहाजों, एक्सप्लांट को छोड़कर) दिन 3 में 0.38 मिमी2 (चित्रा 3 ए),4 दिन में 1.47 मिमी2 (चित्रा 3बी),5.62 मिमी2 दिन में(चित्रा 3C),और 10.09 मिमी2 दिन में 6(चित्रा 3D)था।
फ्री फैटी एसिड रिसेप्टर (एफएफएआर) 4 दमन कोरॉइडल नियोवैस्कुलराइजेशन एक्स वीवो को बढ़ा देता है।
कोरोइडल संवहनी अंकुरण पर FFAR4 (जिसे जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर 120 के रूप में भी जाना जाता है) के नुकसान के प्रभावों का मूल्यांकन कोरॉयड अंकुरण परख18का उपयोग करके किया गया था। कोरॉयड, आरपीई और स्क््लीरा कॉम्प्लेक्स को Ffar4 नॉक आउट (-/-) और Ffar4 +/+ चूहों से विच्छेदित किया गया था और ऊपर वर्णित के रूप में सुसंस्कृत किया गया था । Ffar4 में अंकुरण क्षेत्र-/-6 दिन में Ffar4 + +/+ की तुलना में कोराइडल संवहनी वृद्धि में वृद्धि हुई (पी = ०.००४)(चित्रा 4ए, बी)। FFAR4 agonist (1 μM) के उपचार ने दिन 6 (पी = 0.03)(चित्रा 4सी, डी)पर अनुपचारित चूहों की तुलना में कोराइडल स्प्राउटिंग क्षेत्र को कम कर दिया।
चित्रा 1: योजनाबद्ध चित्रण जिसमें कोरॉइड अंकुरण परख दिखाई गई है।
आंखों को पहले परमाणु और परिक्षित रूप से काट दिया गया था के बारे में ०.५ मिमी अंगों के पीछे । कॉर्निया, आईरिस, लेंस और विट्रियस को हटा दिया गया। फिर आंखों के कप के किनारे से ऑप्टिक नर्व की ओर 1 एमएम कट बनाया गया। एक बैंड तो कटौती किनारे करने के लिए 1.0 मिमी पीछे के बारे में परिधि में कटौती की गई थी और बैंड और परिसर के परिधीय क्षेत्रों को अलग किया गया था। बैंड को लगभग 1 मिमी x 1 मिमी टुकड़ों में काटा गया था और बीएमई में एम्बेडेड किया गया था। फिर एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, कोरॉइड से माइक्रोवैस्कुलर स्प्राउट्स की कल्पना की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: स्विफ्ट-चोरॉइड कंप्यूटरीकृत क्वांटिफिकेशन विधि।
(A,B) जादू की छड़ी समारोह अंकुरित के केंद्र में choroid ऊतक (सफेद तीर) रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया गया था और यह डिजिटल रूप से हटा दिया गया था (शॉर्टकट कुंजी "F1") । (सी, डी) छवि की पृष्ठभूमि को मुफ्त चयन उपकरण (काला तीर) के साथ हटा दिया गया था। तब पृष्ठभूमि और परिधि के खिलाफ दहलीज फ़ंक्शन का उपयोग करके माइक्रोवैस्कुलर स्प्राउट्स को परिभाषित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: माउस पेरिफेरल कोरॉइड अंकुरण।
(ए-डी) C57BL/6J माउस के साथ कोरॉइड स्प्राउट्स की प्रतिनिधि छवियां और स्विफ्ट-कोरॉइड विधि के प्रदर्शन अंकुरित के क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करते हैं। दिन 3(ए)में 0.38 मिमी2, दिन 4(बी)में 1.47 मिमी2, दिन 5(सी)में 5.62 मिमी2 और दिन 6(डी)में 10.09 मिमी2 था। स्केल बार; 500 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: मुफ्त फैटी एसिड रिसेप्टर (FFAR) 4 दमन कोरॉयड नियोवैस्कुलराइजेशन बढ़ा देता है।
(A) फ्री फैटी एसिड रिसेप्टर (Ffar) 4 + /+ से choroid के साथ अंकुरण परख के प्रतिनिधि छवियों Ffar4 नॉक आउट (-/-) चूहों के साथ तुलना में: ऊपरी छवि Ffar4 + के choroid से पता चलता है + + + जबकि कम छवि Ffar4-/-choroid से पता चलता है । (ख)Ffar4-/-FFAr4 + +/+ चूहों (n = 6-8) की तुलना में बढ़ी हुई कोरॉइड अंकुरण दिखाया । (ग) कोरॉइड स्प्राउटिंग की प्रतिनिधि छवियां: ऊपरी छवि वाहन उपचार (नियंत्रण) को दर्शाती है; निचली छवि FFAR4 एगोनिस्ट उपचार को दर्शाती है। (घ) FFAR4 agonist नियंत्रण की तुलना में कोरोइडल अंकुरण दबा (n = 10-12) । स्केल बार = 500 माइक्रोन। डेटा छात्र के टी परीक्षण द्वारा विश्लेषण किया गया और एसई के ± मतलब के रूप में व्यक्त किया गया । * पी & ०.०५; **p< 0.01। इस आंकड़े को टोमिता एट अलसेसंशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक फ़ाइल 1: कोरॉइड स्प्रायटिंग परख कार्यक्रम के लिए प्लगइन्स और शॉर्टकट कैसे बनाएं। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
कोरोइडल अंकुरित परख से नियोवैस्कुलर एएमडी 9 ,10,18,19,20में शोध होता है . कोरॉयड एक्सप्लांट को चूहों के साथ - साथ चूहों और मनुष्यों से अलग किया जा सकता है17,21. कोरॉइड एक्सप्लांट में ईसीएस, मैक्रोफेज और पेरिसाइट्स17शामिल हैं। इस परख में कोरॉयड ईसीएस और आरपीई कोशिकाओं जैसी आसन्न कोशिकाओं के बीच बातचीत, कोरॉइडल वैस्कुलर विकास17में शामिल तंत्र को स्पष्ट करने में मदद करती है। इसके अलावा, यह प्रजनन योग्य और अर्ध-स्वचालित मूल्यांकन विधि इंटरऑब्जर्वर परिवर्तनशीलता17को कम कर देती है।
पूर्व वीवो कोरॉइडल ऊतक के पहले प्रकाशित अध्ययन में डीआर और एएमडी22 , 23 , 24 , 25केइलाज की क्षमता के साथ औषधीय हस्तक्षेपों का परीक्षण करने के लिए अलग - थलग कोरॉइड का उपयोग कियागया। परख ने अंकुरित जहाजों की संख्या और लंबाई की गणना की, जो इंटरऑब्जर्वर परिवर्तनशीलता के अधीन हो सकती है। इसके विपरीत, यहां वर्णित परिमाणीकरण विधि को17मानकीकृत किया गया है। माइक्रोवैस्कुलर कोरॉयड एंजियोजेनेसिस की इस परख में इंटरैक्टिव पार्टनर सेल्स और एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स शामिल हैं। संस्कृति में ईसीएस अपने कई शारीरिक गुणों को खो सकता है, जैसे संवहनी ट्यूब26 बनाने की क्षमता जो आरपीई जैसी अन्य कोशिकाओं के साथ बातचीत के नुकसान के कारण हो सकती है। इसलिए, ईसी इन विट्रो संस्कृतियों को कोरॉइडल नियोवैस्कुलराइजेशन के सभी पहलुओं को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। महाधमनी अंगूठी परख बड़े पोत एंडोथेलियल कोशिकाओं और इंटरैक्टिव कोशिकाओं को बड़े जहाजों से अंकुरण का मूल्यांकन करने के लिए शामिल हैं । लेकिन बड़े पोत अंकुरित होने से कोरोइडल माइक्रोवैस्कुलर रोग27को सही ढंग से प्रतिबिंबित नहीं किया जा सकता है । कोरोइडल स्प्राउटिंग परख कोरोइडल माइक्रोवैस्कुलर प्रतिक्रियाओं का करीब प्रतिनिधित्व है।
महत्वपूर्ण चेतावनी हैं। सबसे पहले, परिधीय कोरॉइड कॉम्प्लेक्स एक्सप्लांट स्प्राउट्स अधिक सुसंगत होते हैं और केंद्रीय वर्ग17के एक्सप्लांट की तुलना में बहुत तेजी से बढ़ते हैं। दूसरा, कोरॉइड से आरपीई को हटाया नहीं गया क्योंकि आरपीई के साथ कोरॉयड स्प्राउट्स आरपीई17के बिना बहुत तेजी से बढ़ते हैं। अकेले कोरॉइड पर एक दवा के प्रभाव को समझने के लिए, आरपीई के बिना परख का उपयोग किया जा सकता है। अंत में, जादू की छड़ी समारोह का उपयोग करके कोरॉइड ऊतक और अंकुरण क्षेत्र की छवि को रेखांकित करते समय, कभी-कभी उच्च पृष्ठभूमि शोर के कारण कोरॉइड अंकुरण के क्षेत्र का पता लगाना मुश्किल होता है। छवियों के बीच भिन्नता हो सकती है। इसलिए, स्थिरता के लिए, कोरॉयड और पृष्ठभूमि के बीच पर्याप्त अंतर बनाना महत्वपूर्ण है जैसा कि चित्र 2 में देखा गया है।
संक्षेप में, पूर्व वीवो कोरॉयड अंकुरण परख की विशेषता और अर्ध-स्वचालित किया गया है। यह विधि एएमडी अनुसंधान के लिए एक प्रयोगात्मक उपकरण प्रदान करती है। इस परख का उपयोग यौगिकों को संभावित उपचार के रूप में स्क्रीन करने या जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस ऊतक का उपयोग करके कोरॉयडल माइक्रो जहाजों के प्रसार में शामिल रास्तों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास कोई वित्तीय खुलासे नहीं हैं । कंप्यूटरीकृत विधि लेखकों के माध्यम से अकादमिक संस्थानों के लिए नि: शुल्क उपलब्ध है।
Acknowledgments
इस काम को मैनपेई सुजुकी डायबिटिक फाउंडेशन (वाईटी), बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल ओएफडी/बीआरईआरसी/सीटीआरईसी फैकल्टी करियर डेवलपमेंट ग्रांट, बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल ऑप्थेलमोलॉजी फाउंडेशन, बीसीएच पायलट अवार्ड, बीसीएच मैन्टन सेंटर फेलोशिप और लिटिल जिराफ फाउंडेशन (जेडएफ), जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । बीसी के लिए [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, बीसीएच IDDRC (1U54HD090255), मैसाचुसेट्स लायंस आई फाउंडेशन (LEHS) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
References
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