Denne protokollen presenterer choroid spirende analyse, en ex vivo modell av mikrovaskulær spredning. Denne analysen kan brukes til å vurdere veier involvert i å spre koroide mikrokar og vurdere medikamentell behandling ved hjelp av vill type og genmodifisert musevev.
Patologisk choroidal angiogenese, et fremtredende trekk ved aldersrelatert makuladegenerasjon, fører til synshemming og blindhet. Endotelcelle (EC) spredningsanalyser ved hjelp av humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECer) eller isolerte primære retinale ECer er mye brukt in vitro-modeller for å studere retinal angiogenese. Imidlertid er det teknisk utfordrende å isolere rene murine retinale endotelceller, og retinale ECer kan ha forskjellige spredningsresponser enn koroidale endotelceller og forskjellige celle/celleinteraksjoner. En svært reproduserbar ex vivo choroidal spirende analyse som en modell av choroidal mikrovaskulær spredning ble utviklet. Denne modellen inkluderer samspillet mellom choroid vaskulatur (EC, makrofager, pericytter) og retinal pigment epitel (RPE). Mus RPE/choroid/scleral explants er isolert og inkubert i vekstfaktorredusert basalmembranekstrakt (BME) (dag 0). Medium endres annenhver dag og choroid spirende er kvantifisert på dag 6. Bildene av individuelle choroid explant er tatt med en invertert fase mikroskop og spireområdet kvantifiseres ved hjelp av en semi-automatisert makro plug-in til ImageJ programvare utviklet i dette laboratoriet. Denne reproduserbare ex vivo choroidal spirende analysen kan brukes til å vurdere forbindelser for potensiell behandling og for mikrovaskulær sykdom forskning for å vurdere veier involvert i choroidal mikro fartøy spredning ved hjelp av vill type og genmodifisert musvev.
Choroidal angiogenese dysregulering er forbundet med neovaskulær aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)1. Choroid er en mikrovaskulær seng tilstede under retinal pigment epitel (RPE). Det har vist seg at redusert blodstrøm i choroid er forbundet med progresjon av AMD2. Det intrikate forholdet mellom vaskulær endotel, RPE, makrofager, pericytter og andre celler er ansvarlig for homeostase avvevet 3,4,5. Derfor er en reproduserbar analyse modellering koroid mikromiljø kritisk for studiet av neovaskulær AMD.
Ex vivo angiogenese analyser og in vitro endotelcellekulturer kan utfylle studier av mikrovaskulær atferd in vivo, for testing av nye legemidler og for studier av patogenese. Endotelceller som humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECs), Human Navlestreng Vene Endotelceller (HUVEC), isolert primær dyrehjerne eller retinale ECer brukes ofte i in vitro-studier for okulær angiogeneseforskning6,7,8. HRMECs spesielt har blitt mye brukt som en modell av in vitro choroidal neovascularization (CNV)9 ved å vurdere endotelspredning, migrasjon, rørformet dannelse og vaskulær lekkasje for å evaluereintervensjoner 6,10. Imidlertid er ECer i kultur begrenset som en modell av CNV på grunn av mangel på interaksjoner med andre celletyper som finnes i choroid og fordi de fleste EC brukes i disse analysene ikke stammer fra choroid. Mus koroide ECer er vanskelig å isolere og vedlikeholde i kultur.
Aortaringanalysen er mye brukt som en modell for makrovaskulær spredning. Vaskulære spirer fra aorta explants inkluderer EC, pericytes og makrofager11. Aorta ring analyse modeller store fartøyet angiogenesebrønn 12,13,14. Det har imidlertid begrensninger som en modell av choroidal neovaskularisering som aortaringer er et makrovaskulært vev som mangler det karakteristiske koroide mikrovaskulære miljøet, og spirer fra store fartøy kan avvike fra spirer fra kapillære nettverk involvert i mikrovaskulær patologi. Nylig publiserte en gruppe en ex-vivo retinal analyse15,16. Selv om det er egnet for retinal neovaskulær sykdom, er det ikke så hensiktsmessig for choroidal neovaskularisering som sett i AMD.
Den koroide spirende analysen ved hjelp av mus RPE, choroid og scleral explanted vev ble utviklet for å bedre modell CNV. Vevet kan lett isoleres fra mus (eller andre arter) øyne17. Denne analysen tillater reproduserbar evaluering av pro- og anti-angiogent potensial av farmakologiske forbindelser og evaluering av rollen til spesifikke veier i choroidal neovaskularisering ved hjelp av vev fra genmodifiserte musog kontroller 18. Denne koroide spirende analysen har blitt referert i mange påfølgendepublikasjoner 9,10,18,19,20. Her demonstreres metoden som er involvert i bruken av denne analysen.
Den koroide spirende analysen hjelpemidler forskning i neovaskulær AMD9,10,18,19,20. Choroid explants kan isoleres fra mus samt rotter og mennesker17,21. Choroid explant inkluderer EC, makrofager og pericytes17. I denne analysen bidrar samspillet mellom koroide ECer og tilstøt…
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet av Grants fra Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children’s Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children’s Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship og Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; til BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |