En ex vivo choroid spirende analyse av okulær mikrovaskulær angiogenese

Summary

Denne protokollen presenterer choroid spirende analyse, en ex vivo modell av mikrovaskulær spredning. Denne analysen kan brukes til å vurdere veier involvert i å spre koroide mikrokar og vurdere medikamentell behandling ved hjelp av vill type og genmodifisert musevev.

Abstract

Patologisk choroidal angiogenese, et fremtredende trekk ved aldersrelatert makuladegenerasjon, fører til synshemming og blindhet. Endotelcelle (EC) spredningsanalyser ved hjelp av humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECer) eller isolerte primære retinale ECer er mye brukt in vitro-modeller for å studere retinal angiogenese. Imidlertid er det teknisk utfordrende å isolere rene murine retinale endotelceller, og retinale ECer kan ha forskjellige spredningsresponser enn koroidale endotelceller og forskjellige celle/celleinteraksjoner. En svært reproduserbar ex vivo choroidal spirende analyse som en modell av choroidal mikrovaskulær spredning ble utviklet. Denne modellen inkluderer samspillet mellom choroid vaskulatur (EC, makrofager, pericytter) og retinal pigment epitel (RPE). Mus RPE/choroid/scleral explants er isolert og inkubert i vekstfaktorredusert basalmembranekstrakt (BME) (dag 0). Medium endres annenhver dag og choroid spirende er kvantifisert på dag 6. Bildene av individuelle choroid explant er tatt med en invertert fase mikroskop og spireområdet kvantifiseres ved hjelp av en semi-automatisert makro plug-in til ImageJ programvare utviklet i dette laboratoriet. Denne reproduserbare ex vivo choroidal spirende analysen kan brukes til å vurdere forbindelser for potensiell behandling og for mikrovaskulær sykdom forskning for å vurdere veier involvert i choroidal mikro fartøy spredning ved hjelp av vill type og genmodifisert musvev.

Introduction

Choroidal angiogenese dysregulering er forbundet med neovaskulær aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)¹. Choroid er en mikrovaskulær seng tilstede under retinal pigment epitel (RPE). Det har vist seg at redusert blodstrøm i choroid er forbundet med progresjon av AMD². Det intrikate forholdet mellom vaskulær endotel, RPE, makrofager, pericytter og andre celler er ansvarlig for homeostase av^{vevet 3,4,5}. Derfor er en reproduserbar analyse modellering koroid mikromiljø kritisk for studiet av neovaskulær AMD.

Ex vivo angiogenese analyser og in vitro endotelcellekulturer kan utfylle studier av mikrovaskulær atferd in vivo, for testing av nye legemidler og for studier av patogenese. Endotelceller som humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECs), Human Navlestreng Vene Endotelceller (HUVEC), isolert primær dyrehjerne eller retinale ECer brukes ofte i in vitro-studier for okulær angiogeneseforskning^6,7,8. HRMECs spesielt har blitt mye brukt som en modell av in vitro choroidal neovascularization (CNV)⁹ ved å vurdere endotelspredning, migrasjon, rørformet dannelse og vaskulær lekkasje for å evaluere^{intervensjoner 6,10}. Imidlertid er ECer i kultur begrenset som en modell av CNV på grunn av mangel på interaksjoner med andre celletyper som finnes i choroid og fordi de fleste EC brukes i disse analysene ikke stammer fra choroid. Mus koroide ECer er vanskelig å isolere og vedlikeholde i kultur.

Aortaringanalysen er mye brukt som en modell for makrovaskulær spredning. Vaskulære spirer fra aorta explants inkluderer EC, pericytes og makrofager¹¹. Aorta ring analyse modeller store fartøyet angiogenese^{brønn 12,13,14}. Det har imidlertid begrensninger som en modell av choroidal neovaskularisering som aortaringer er et makrovaskulært vev som mangler det karakteristiske koroide mikrovaskulære miljøet, og spirer fra store fartøy kan avvike fra spirer fra kapillære nettverk involvert i mikrovaskulær patologi. Nylig publiserte en gruppe en ex-vivo retinal analyse^15,16. Selv om det er egnet for retinal neovaskulær sykdom, er det ikke så hensiktsmessig for choroidal neovaskularisering som sett i AMD.

Den koroide spirende analysen ved hjelp av mus RPE, choroid og scleral explanted vev ble utviklet for å bedre modell CNV. Vevet kan lett isoleres fra mus (eller andre arter) øyne¹⁷. Denne analysen tillater reproduserbar evaluering av pro- og anti-angiogent potensial av farmakologiske forbindelser og evaluering av rollen til spesifikke veier i choroidal neovaskularisering ved hjelp av vev fra genmodifiserte mus^{og kontroller 18}. Denne koroide spirende analysen har blitt referert i mange påfølgende^{publikasjoner 9,10,18,19,20}. Her demonstreres metoden som er involvert i bruken av denne analysen.

Protocol

Alle dyreforsøk beskrevet ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Boston Children’s Hospital (ARCH protokollnummer 19-04-3913R). 1. Forberedelse Tilsett 5 ml Penicillin/Streptomycin (10000 E/ml) og 5 ml og 10 ml kommersielt tilgjengelige kosttilskudd til 500 ml komplett klassisk medium med serum. Aliquot 50 ml av mediet i utgangspunktet.MERK: Ikke returner noe medium tilbake til lageret for å unngå kontaminering. Legg en aliquot av komplett kl…

Representative Results

Sammenligning av choroid spirende vekst per dag Vi dissekerte choroid med sclera, innebygd i BME og kultivert dem i 6 dager (Figur 1). Choroidspirende i C57BL/6J-mus fra dag 3 til dag 6 ble undersøkt med et mikroskop og kvantifisert med SWIFT-Choroid en halvautomatisk kvantifiseringsmetode i ImageJ. I et representativt tilfelle var det koroide spireområdet (fartøyene som strekker seg fra skrå, unntatt selve utstrakte) 0,38 mm2 på d…

Discussion

Den koroide spirende analysen hjelpemidler forskning i neovaskulær AMD^{9,10,18,19,20}. Choroid explants kan isoleres fra mus samt rotter og mennesker^17,21. Choroid explant inkluderer EC, makrofager og pericytes¹⁷. I denne analysen bidrar samspillet mellom koroide ECer og tilstøt…

Materials

AnaSed (Xylazine)	AKORN	59339-110-20
Basal membrane extract (BME) Matrigel	BD Biosciences	354230
Cell culture dish	NEST	704001	10cm
Complete classic medium with serum and CultureBoost	Cell systems	4Z0-500
Ethyl alcohol 200 Proof	Pharmco	111000200	use for 70%
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666
Microscope	ZEISS	Axio Observer Z1
Penicillin/Streptomycin	GIBCO	15140	10000 U/mL
Tissue culture plate (24-well)	Olympus	25-107
VetaKet CIII (Ketamine)	AKORN	59399-114-10