Summary
Denne protokol præsenterer choroid spiring assay, en ex vivo model af mikrovaskulær spredning. Denne analyse kan bruges til at vurdere veje involveret i prolifererende choroidal mikro fartøjer og vurdere narkotika behandlinger ved hjælp af vilde type og genetisk modificerede musevæv.
Abstract
Patologisk choroidal angiogenese, en fremtrædende funktion af aldersrelateret makuladegeneration, fører til synsnedsættelse og blindhed. Endotelcelle (EF) spredningsanalyser ved hjælp af humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC' er) eller isolerede primære nethinde-EC'er anvendes i vid udstrækning in vitro-modeller til undersøgelse af retinal angiogenese. Men, isolere ren murine retinale endotelceller er teknisk udfordrende og retinale ECs kan have forskellige spredning svar end choroidal endotelceller og forskellige celle / celle interaktioner. En meget reproducerbar ex vivo choroidal spiring assay som en model af choroidal mikrovaskulær spredning blev udviklet. Denne model omfatter samspillet mellem choroid vaskulatur (EF, makrofager, pericytter) og retinale pigment epitel (RPE). Muse-RPE/choroid/scleral explants isoleres og inkuberes i vækstfaktorredrimeret basalmembranekstrakt (BME) (dag 0). Medium ændres hver anden dag og choroid spiring kvantificeres på dag 6. Billederne af individuelle choroid explant er taget med en omvendt fase mikroskop og spiring område kvantificeres ved hjælp af en semi-automatiseret makro plug-in til ImageJ software udviklet i dette laboratorium. Denne reproducerbare ex vivo choroidal spiringsanalyse kan anvendes til at vurdere forbindelser til potentiel behandling og til mikrovaskulær sygdomsforskning for at vurdere veje, der er involveret i choroidal mikrokarprolifeion ved hjælp af vildtype og genetisk modificeret musevæv.
Introduction
Choroidal angiogenese dysregulation er forbundet med neovaskulær aldersrelateret makuladegeneration (AMD)1. Den choroid er en mikrovaskulær seng til stede under retinale pigment epitel (RPE). Det er blevet påvist, at nedsat blodgennemstrømning i choroid er forbundet med progression af AMD2. Det indviklede forhold mellem vaskulær endotel, RPE, makrofager, pericytter og andre celler er ansvarlig for homøostaseafvævet3,4,5. Derfor er en reproducerbar analyse modellering choroidal mikromiljø er afgørende for studiet af neovaskulær AMD.
Ex vivo angiogenese analyser og in vitro endotel cellekulturer kan supplere undersøgelser af mikrovaskulær adfærd in vivo, til test af nye lægemidler og for undersøgelser af patogenese. Endotelceller såsom humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC), Human Umbilical Vein Enothelial Cells (HUVEC), isolerede primære dyrs hjerne eller retinale ECs anvendes ofte i in vitro-undersøgelser til okulær angiogenese forskning6,7,8. Især HRMEC'er har været meget anvendt som model for in vitro choroidal neovaskulærisation (CNV)9 ved at vurdere endotelspredning, migration, rørformet dannelse og vaskulær lækage til vurdering afinterventioner 6,10. EC'er i kultur er imidlertid begrænset som en model af CNV på grund af manglende interaktioner med andre celletyper, der findes i choroid, og fordi de fleste EF, der anvendes i disse analyser, ikke stammer fra choroid. Mus choroidal ECs er vanskelige at isolere og vedligeholde i kulturen.
Den aorta ring assay er meget udbredt som en model af makro vaskulær spredning. Vaskulære spirer fra aorta explants omfatter ECs, pericytes og makrofager11. Den aorta ring assay modeller store fartøj angiogenese godt12,13,14. Men det har begrænsninger som en model af choroidal neovascularization som aorta ringe er en makrovaskulær væv mangler den karakteristiske choroidal mikrovaskulære miljø, og spirer fra store fartøjer kan afvige fra spirer fra kapillære netværk, der er involveret i mikrovaskulær patologi. For nylig offentliggjorde en gruppe en ex-vivo retinal analyse15,16. Selv om det er egnet til retinal neovaskulær sygdom, er det ikke så hensigtsmæssigt for choroidal neovascularization som set i AMD.
Den choroidal spirende assay ved hjælp af mus RPE, choroid, og scleral explanted væv blev udviklet til bedre model CNV. Vævet kan nemt isoleres fra mus (eller andre arter) øjne17. Denne analyse gør det muligt at reproducere pro- og anti-angiogene potentiale af farmakologiske forbindelser og evaluere den rolle, som specifikke veje i choroidal neovaskulærisering ved hjælp af væv fra genetisk modificerede mus ogkontrol 18. Denne choroidal spirende analyse er blevet refereret i mange efterfølgende publikationer9,10,18,19,20. Her er den metode, der er involveret i brugen af denne analyse er påvist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne dyreforsøg blev godkendt af Udvalget for Institutionel Dyrepleje og -anvendelse på Boston Children's Hospital (ARCH-protokolnummer 19-04-3913R).
1. Forberedelse
- Der tilsættes 5 ml Penicillin/Streptomycin (10000 U/ml) og 5 ml og 10 ml kommercielt tilgængelige kosttilskud til 500 ml komplet klassisk medium med serum. Aliquot 50 ml af mediet i første omgang.
BEMÆRK: Tilbagelever ikke noget medium til lageret for at undgå kontaminering. - Sæt en aliquot af komplet klassisk medium på is.
- Brug 70% ethanol til at rense dissekeremikroskopet, fortræt og en saks.
- Forbered to cellekulturretter (10 cm), en på dissektionsmikroskopet, en på is; sætte 10 ml komplet klassisk medium i hver skål.
2. Eksperimentelle skridt (Figur 1)
- Sacrifice C57BL/6J mus omkring postnatal (P) 20 ved hjælp af 75-100 mg/kg ketamin og 7,5 -10 mg/kg xylazine injiceres intraperitoneally. Hold øjnene i komplet klassisk medium på is før dissektion.
- Fjern bindevæv (muskel og fedtvæv) og synsnerven på øjet.
- Brug en mikro-saks til circumferentially skære 0,5 mm posteriort til hornhinden limbus. Fjern hornhinden / iris kompleks, glaslege, og linsen.
- Lav et 1 mm snit vinkelret på den afskårne kant mod synsnerven og skær et omkredsbånd med en bredde på 1 mm. Adskaf kompleksets centrale og perifere regioner. Brug viceiner til at skrælle nethinden af RPE/choroid/sclera-kompleks.
- Hold det perifere choroid bånd i komplet klassisk medium på is; isolere det andet øje og gentage processen for at skære et andet bånd.
- Skær det cirkulære bånd i 6 ~lige firkantede stykker (~ 1 mm x 1 mm).
BEMÆRK: Rør aldrig ved nogen kant. - Tø det basale membranekstrakt (BME) pr. fremstillingsinstruktion. Tilsæt 30 μL / brønd af BME i midten af hver brønd af en 24 godt væv kultur plade. Sørg for, at BME's dråbe danner en konveks kuppel i bunden af pladen uden at røre kanterne.
BEMÆRK: Tø BME natten over i køleskab. BME skal være på isen når som helst efter optøning. - Placer vævet i midten af BME.
BEMÆRK: Må ikke flade choroid explant; generelt, lad vævet udvide inden for BME. Vævs orientering (scleral side op eller ned) påvirker ikke forsøgsresultatet. - Pladen inkuberes ved 37 °C i 10 minutter for at lade gelen størkne.
- Der tilsættes 500 μL af det komplette klassiske medium/brønd.
- Skift det klassiske medium hver anden dag (500 μL). Choroid spiring kan observeres efter 3 dage med et mikroskop.
BEMÆRK: For vækstfaktor behandling, sulte vævet i 4 timer. Fortynd en forsøgsblanding i vækstfaktor-reduceret medium (1:200 boost i stedet for 1:50).
3.SWIFT-Choroid edb-kvantificeringsmetode17 (Figur 2)
BEMÆRK: Der blev anvendt en edb-metode til måling af det område, der er dækket af dyrkningsfartøjer. Der er behov for et makroplugt til ImageJ-software før kvantificering (se Supplerende oplysninger for yderligere oplysninger).
- Åbn choroid spiring billedet med ImageJ og kontrollere "| Skriv| 8-bit" med grå skala.
- Gå til "Billede | Juster | Lysstyrke/kontrast (Ctrl/skift/C)" og optimer kontrasten.
- Brug tryllestavfunktionen til at skitsere og fjerne choroidvævet fra billedet, som er til stede i midten af spirerne (ved hjælp af genvejstasten "F1") (Figur 2A, B).
BEMÆRK: Indstil tolerancen for tryllestaven til 20-30%. - Fjern billedets baggrund med de gratis markeringsværktøjer (Figur 2C). Gå til "Billede | Juster | Tærskel (Ctrl/skift/T)". Brug tærskelfunktionen til at definere de mikrovaskulære spirer på baggrund og periferi (Figur 2D).
- Klik på "F2", vises en oversigt. Gem et billede af det markerede område ved at klikke på "Gem". Gem i den samme mappe som det oprindelige billede til fremtidig reference.
- Når en gruppe prøver er målt, skal du kopiere den registrerede til dataanalyse.
BEMÆRK: Det er også muligt at måle arealet (μm²) ved at "analysere | Indstil Skalering" ved hjælp af billeder med skalerlinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenligning af choroid spirende vækst per dag
Vi dissekeret choroid med sclera, indlejret i BME og dyrkede dem i 6 dage(Figur 1). Choroid spiring i C57BL/6J mus fra dag 3 til dag 6 blev undersøgt med et mikroskop og kvantificeret med SWIFT-Choroid en semi-automatiseret kvantificering metode i ImageJ. I et repræsentativt tilfælde var det choroidalspiringsområde (de fartøjer, der strækker sig fra explanten, bortset fra selve explanten) 0,38 mm2 ved dag 3 (Figur 3A), 1,47 mm2 ved dag 4 ( Figur3B), 5,62 mm2 på dag 5 ( Figur3C) og 10,09 mm2 på dag 6 (figur 3D).
Fri fedtsyre receptor (FFAR)4 undertrykkelse forværrer choroidal neovascularization ex vivo.
Virkningerne af tab af FFAR4 (også kendt som G -protein koblet receptor 120) på choroidal vaskulær spiring blev evalueret ved hjælp af choroid spiring assay18. Den choroid, RPE, og sclera kompleks blev dissekeret fra Ffar4 knock out (-/-) og Ffar4 + + + mus og dyrket som beskrevet ovenfor. Spireområdet i Ffar4-/- øget choroidal vaskulær vækst sammenlignet med Ffar4+/+ på dag 6 (p = 0,004) (Figur 4A, B). Behandlingen af FFAR4 agonist (1 μM) reducerede det choroidal spiringsområde sammenlignet med ubehandlede mus på dag 6 (p = 0,03) (Figur 4C,D).
Figur 1: Skematisk illustration, der viser choroid spiringsanalyse.
Øjne blev først enucleated og skæres circumferentially omkring 0,5 mm posteriort til limbus. Hornhinden, iris, linse og glaslege, blev fjernet. Derefter blev der lavet et 1 mm snit fra kanten af øjenkoppen mod synsnerven. Et bånd blev derefter skåret circumferentially omkring 1,0 mm posteriort til den afskårne kant og båndet og de perifere områder af komplekset blev adskilt. Båndet blev skåret i ca. 1 mm x 1 mm stykker og indlejret i BME. Derefter ved hjælp af et mikroskop, blev de mikrovaskulære spirer fra choroid visualiseret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: EDB-kvantificeringsmetode for SWIFT-Choroid.
(A,B) Tryllestav funktion blev brugt til at skitsere choroid væv (hvid pil) i midten af spirer, og det blev fjernet digitalt (Genvejstast "F1"). C, D) Baggrunden på billedet blev fjernet med de gratis markeringsværktøjer (sort pil). Mikrovaskulære spirer blev derefter defineret ved hjælp af tærskelfunktionen på baggrund og periferi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Mus perifere choroid spiring.
(A-D) Repræsentative billeder af choroid spirer med en C57BL/6J mus og demonstrationer af SWIFT-Choroid metode kvantificere det område af spirer. Det choroidal spiring område var 0,38 mm2 på dag 3 (A),1,47 mm2 på dag 4 (B),5,62 mm2 på dag 5 (C), og 10,09 mm2 på dag 6 (D). Skalalinje; 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fri fedtsyrereceptor (FFAR) 4 undertrykkelse forværrer choroidal neovaskulærisering.
(A)Repræsentative billeder af spiring assay med choroid fra Free fedtsyre receptor (Ffar) 4 + / + sammenlignet med Ffar4 knock out (-/-) mus: øvre billede viser choroid af Ffar4 + / + mens lavere billede viser Ffar4-/- choroid. (B)Ffar4-/- viste øget choroid spiring sammenlignet med Ffar4 +/+ mus (n = 6-8). c) Repræsentative billeder af choroid spiring: øverste billede viser køretøjets behandling (kontrol); lavere billede viser FFAR4 agonist behandling. (D) FFAR4 agonist undertrykt choroidal spiring i forhold til kontrol (n = 10-12). Skalastænger = 500 μm. Dataene blev analyseret af Student's t-test og blev udtrykt som middelværdi ± SE. * p < 0,05; **p < 0,01. Dette tal er blevet ændret fra Tomita et al.18. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Fil 1: Sådan oprettes plugins og genveje til choroid spiring assay program. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den choroidal spirende assay hjælpemidler forskning i neovaskulær AMD9,10,18,19,20. Choroid explants kan isoleres fra mus samt rotter og mennesker17,21. Choroid explant omfatter EC'er, makrofager og pericytes17. I denne analyse samspillet mellem choroidal ECs og tilstødende celler såsom RPE celler, hjælpe med at belyse de mekanismer, der er involveret i choroidal vaskulær vækst17. Desuden reducerer denne reproducerbare og halvautomatiske vurderingsmetode interobserveration variabilitet17.
Den første offentliggjorte undersøgelse af eks vivo choroidal væv anvendte isoleret choroid til at teste farmakologiske indgreb med potentiale til behandling af DR og AMD22,23,24,25. Analysen talte antallet og længden af spirende fartøjer, som kan være genstand for interobserver variation. I modsætning hertil er den her beskrevne kvantificeringsmetode blevetstandardiseret 17. Denne analyse af mikrovaskulær choroid angiogenese omfatter interaktive partnerceller og ekstracellulær matrix. EC i kultur kan miste mange af deres fysiologiske egenskaber, såsom evnen til at danne vaskulære rør26, som kan skyldes tab af interaktion med andre celler såsom RPE. Derfor afspejler EF in vitro-kulturer muligvis ikke alle aspekter af choroidal neovaskulærisering. Aorta ring assay omfatter store fartøj endotelceller og interaktive celler til at evaluere spiring fra store fartøjer. Men store karspirer afspejler måske ikke nøjagtigt choroidal mikrovaskulær sygdom27. Den choroidal spiring assay er en tættere repræsentation af choroidal mikrovaskulære reaktioner.
Der er vigtige forbehold. For det første er de perifere choroid komplekse explant spirer mere konsekvente og vokse meget hurtigere end explants fra de centrale sektioner17. For det andet blev RPE fra choroid ikke fjernet, fordi choroid spirer med RPE vokse meget hurtigere end uden RPE17. For at forstå virkningen af et lægemiddel på choroid alene, analysen uden RPE kan anvendes. Endelig, når skitserer billedet af choroid væv og spiring område ved hjælp af tryllestav funktion, er det nogle gange vanskeligt at spore det område af choroid spiring på grund af høj baggrundsstøj. Der kan være variation mellem billeder. Derfor er det vigtigt at skabe tilstrækkelig kontrast mellem choroid og baggrund digitalt, som det ses i figur 2.
Sammenfattende, ex vivo choroid spiring assay er blevet karakteriseret og semi-automatiseret. Denne metode giver et eksperimentelt værktøj til AMD forskning. Denne analyse kan bruges til at screene forbindelser som potentielle behandlinger eller til at vurdere veje involveret i prolifererende choroidal mikro fartøjer ved hjælp af vilde type og genetisk modificerede musevæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen finansielle oplysninger. Den edb-metode er gratis tilgængelig for akademiske institutioner gennem forfatterne.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af Grants fra Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Oftalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship og Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; til BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
References
- Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
- Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
- Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
- Fu, Z., et al.
- Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
- Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
- Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
- Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
- Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
- Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Bellacen, K., Lewis, E. C.
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
- Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
- Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
- Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
- Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
- Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
- Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
- Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
- Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
- Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
- Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
- Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).
