Subretinale Transplantation von menschlichem embryonalem Stammzellgewebe in einem katzenartigen Großtiermodell

Summary

Hier wird eine Operationstechnik zur Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnenem Netzhautgewebe in den subretinalen Raum eines Großtiermodells vorgestellt.

Abstract

Degenerative (RD) Netzhauterkrankungen, die mit dem Verlust von Photorezeptoren einhergehen, wie z. B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD), Retinitis pigmentosa (RP) und Leber-kongenitale Amaurose (LCA), verursachen einen fortschreitenden und schwächenden Sehverlust. Es besteht ein ungedeckter Bedarf an Therapien, die das Sehvermögen wiederherstellen können, wenn die Photorezeptoren verloren gegangen sind. Die Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnenem Netzhautgewebe (Organoiden) in den subretinalen Raum eines Auges mit fortgeschrittener RD bringt Netzhautgewebeblätter mit Tausenden von gesunden, mutationsfreien Photorezeptoren und hat das Potenzial, die meisten/alle Erblindungskrankheiten, die mit Photorezeptordegeneration verbunden sind, mit einem zugelassenen Protokoll zu behandeln. Die Transplantation von fetalem Netzhautgewebe in den subretinalen Raum von Tiermodellen und Menschen mit fortgeschrittener RD wurde erfolgreich entwickelt, kann aber aufgrund ethischer Bedenken und begrenzter Gewebeversorgung nicht als Routinetherapie eingesetzt werden. Tiermodelle für große, am Auge vererbte Netzhautdegeneration (IRD) sind wertvoll für die Entwicklung von Therapien zur Wiederherstellung des Sehvermögens, bei denen fortschrittliche chirurgische Ansätze zur Transplantation von Netzhautzellen/-gewebe in den subretinalen Raum verwendet werden. Die Ähnlichkeiten in der Größe des Bulbus und der Verteilung der Photorezeptoren (z. B. das Vorhandensein einer Makula-ähnlichen Region Area centralis) und die Verfügbarkeit von IRD-Modellen, die die menschliche IRD genau rekapitulieren, würden eine schnelle Translation einer vielversprechenden Therapie in die Klinik erleichtern. Hier wird eine chirurgische Technik zur Transplantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe in den subretinalen Raum eines Großtiermodells vorgestellt, die es ermöglicht, diesen vielversprechenden Ansatz in Tiermodellen zu bewerten.

Introduction

Millionen von Menschen auf der ganzen Welt sind von Netzhautdegeneration (RD) betroffen, was zu einer Sehbehinderung oder Blindheit führt, die mit dem Verlust der lichtempfindlichen Photorezeptoren (PRs) einhergeht. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine der Hauptursachen für Erblindung, die auf eine Kombination aus genetischen Risikofaktoren und Umwelt-/Lebensstilfaktoren zurückzuführen ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass über 200 Gene und Loci vererbte RD (IRD⁾ verursachen1. Retinitis pigmentosa (RP), die häufigste IRD, ist genetisch heterogen mit mehr als 3.000 genetischen Mutationen in etwa 70 Genen, die berichtet wurden ^2,3,4. Die Leber-Kongenitale Amaurose (LCA), die im Kindesalter zur Erblindung führt, ist ebenfalls genetisch heterogen ^5,6. Die Genaugmentationstherapie wurde entwickelt und befindet sich in klinischen Studien zur Behandlung einer kleinen Anzahl von IRDs ^3,7. Für die Behandlung jeder einzelnen genetischen Form der IRD muss jedoch eine eigene Therapie entwickelt werden, wobei nur eine kleine Untergruppe von Patienten behandelt werden kann. Darüber hinaus beruht die Genaugmentation auf dem Vorhandensein einer Population von rettbaren Photorezeptoren und ist daher bei fortgeschrittener Degeneration nicht anwendbar.

Es besteht daher ein dringender und noch ungedeckter klinischer Bedarf an der Entwicklung von Therapien zur Behandlung fortgeschrittener RDs und hochgradiger Blindheit bis zum Endstadium. In den letzten 2 Jahrzehnten wurden neuroprothetische Implantate entwickelt und in Großtiermodellen, wie z.B. der Katze, vor^{dem Einsatz beim} Menschen getestet 8,9,10,11,12,13,14. Ebenso wurden in den letzten 20 Jahren Netzhautersatztherapien entwickelt, bei denen Schichten aus embryonaler oder sogar reifer Säugetiernetzhaut subretinal transplantiert wurden 15,16,17,18,19,20,21,22 und sogar erfolgreich an RD-Patienten getestet wurden ^23,24,25. Beide Ansätze nutzen die Idee, neue Sensoren (photovoltaische Silizium-Fotodioden im Falle von Neuroprothesen^26,27 und gesunde mutationsfreie Photorezeptoren, die in Schichten organisiert sind^, im Falle der Implantation von Netzhautblättern) in die Netzhaut mit degenerierten PRs einzuführen. Neuere Studien haben die Verwendung stammzellbasierter Ansätze untersucht, wie z. B. die Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnenen Netzhautvorläuferzellen^28,29, hPSC-Photorezeptoren 30 und hPSC-Netzhautorganoiden^31,32,33. Retinale Organoide ermöglichen die Bildung von Netzhautgewebe in einer Schale und die Ableitung von Photorezeptorblättern mit Tausenden von mutationsfreien PRs, die der Photorezeptorschicht in der sich entwickelnden menschlichen fetalen Netzhaut ähneln 34,35,36,37,38,39,40 . Die Transplantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe (Organoide) in den subretinalen Raum von Patienten mit RD-Erkrankungen ist einer der neuen und vielversprechenden Ansätze für die Zelltherapie, der von einer Reihe von Teams verfolgt^{wird 31,32,41,42}. Im Vergleich zur Transplantation der Zellsuspension (von jungen Photorezeptoren oder retinalen Vorläuferzellen) konnte in klinischen Studien gezeigt werden, dass transplantierte Schichten fetaler Photorezeptoren zu einer Verbesserung des Sehvermögens führen^23,24.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt detailliert ein Transplantationsverfahren zur subretinalen Verabreichung der gesamten Netzhaut-Organoide (anstelle von Organoid-Rändern^33,41) als eine potenziell bessere Möglichkeit, intakte Netzhautblätter mit PRs einzuführen^, um das Transplantatüberleben zu erhöhen und die Blattkonservierung zu verbessern. Obwohl Verfahren zum Einbringen eines flachen Stücks menschlicher Netzhaut und auch RPE-Pflaster entwickelt wurden^43,44,45, wurde die Transplantation größerer 3D-Transplantate nicht untersucht. Aus Stammzellen gewonnene Netzhautorganoide bieten eine unerschöpfliche Quelle von Photorezeptorblättern für die Entwicklung von Technologien zur Wiederherstellung des Sehvermögens, sind frei von ethischen Einschränkungen und gelten als hervorragende Quelle für menschliches Netzhautgewebe für Therapien, die sich auf die Behandlung von fortgeschrittener RD und terminaler Blindheit konzentrieren⁴⁶. Die Entwicklung chirurgischer Methoden zur präzisen subretinalen Implantation von retinalen Organoiden mit minimaler Schädigung der retinalen Wirtsnische (neuronale Netzhaut, retinales Pigmentepithel sowie retinale und choroidale Gefäße) ist einer der entscheidenden Schritte, um eine solche Therapie in Richtung klinischer Anwendungen voranzutreiben^31,32. Großtiermodelle wie Katzen, Hunde, Schweine und Affen haben sich als gute Modelle erwiesen, um chirurgische Verabreichungsmethoden zu untersuchen sowie die Sicherheit von implantierten Gewebeschichten (retinale Pigmentepithelzellen (RPE) zu demonstrieren und die Verwendung von Organoiden zu untersuchen 41,44,45,47,48,49,50. Das große Tierauge hat eine ähnliche Kugelgröße wie der Mensch sowie eine ähnliche Anatomie, einschließlich des Vorhandenseins einer Region mit hoher Photorezeptordichte, einschließlich Zapfen (der Area centralis), die der menschlichen Makula ähnelt 6,51,52.

In diesem Manuskript wird eine Technik zur Implantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe (Organoiden) in den subretinalen Raum von felinen Großtiermodellen (sowohl Wildtyp- als auch Crx^Rdy/+-Katzen) beschrieben, die zusammen mit vielversprechenden Wirksamkeitsergebnissen^32,53 eine Grundlage für die weitere Entwicklung einer solchen Prüftherapie in Richtung klinischer Anwendungen zur Behandlung von RD-Erkrankungen bildet.

Protocol

Die Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt. Sie wurden auch vom Institutional Animal Care and Use Committee der Michigan State University genehmigt. In dieser Studie wurden Wildtyp- und CrxRdy/+ -Katzen aus einer Katzenkolonie verwendet, die an der Michigan State University gehalten wurde. Die Tiere wurden unter 12 h : 12 h Hell-Dunkel-Zy…

Representative Results

Dieses Verfahren ermöglicht die erfolgreiche und reproduzierbare Implantation von hPSC-abgeleiteten Netzhautorganoiden in den subretinalen Raum eines Tiermodells mit großen Augen (hier demonstriert anhand von 2 Beispielen: Wildtyp-Katzen mit gesunden Photorezeptoren (PRs) und CrxRdy/+ -Katzen mit degenerierenden PRs und Netzhaut). Bereiten Sie die aus hPSC gewonnenen Netzhautorganoide mit den in Abbildung 1 angegebenen Schritten vor und laden Sie sie in die Bor…

Discussion

Die Implantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe (Netzhautorganoide) in den subretinalen Raum ist ein vielversprechender experimenteller Ansatz zur Wiederherstellung des Sehvermögens bei degenerativen Netzhauterkrankungen im Spätstadium, die durch den Tod von PR-Zellen (hochgradige oder terminale Blindheit) verursacht werden. Der vorgestellte Ansatz baut auf einer zuvor entwickelten und erfolgreich getesteten experimentellen Therapie auf, die auf der subretinalen Transplantation eines Stücks menschlichen fetalen …

Materials

0.22 µm pore syringe filter with PES membrane	Cameo	NA	can be found by various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula	DORC	1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe	Hamilton	NA	can be found by various suppliers
6-0 Silk suture	Ethicon	707G
6-0/7-0 polyglactin suture	Ethicon	J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject)	Henry Schein Animal Health	NA	can be found by various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Par Pharmaceutical	NA	can be found by various suppliers
cSLO + SD-OCT	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine	Novartis	NA	can be found by various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium)	Vetone	NA	can be found by various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL	Cipla	NA	can be found by various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarnital solution)	Vortech	NA	can be found by various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL	Hospira	NA	can be found by various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing	World Precision Instruments	TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL	Pfizer	NA	can be found by various suppliers
Microscope	Zeiss	NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound)	Sakura	4583
Olympic Vac-Pac Size 23	Natus	NA	can be found by various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution	EMS	15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution	Akorn	NA	can be found by various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL	Akorn	NA	can be found by various suppliers
Propofol 5000mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28)	Zoetis	NA	can be found by various suppliers
RetCam II video fundus camera	Clarity Medical Systems	NA	can be found by various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40)	Bristol -Myers Squibb Company	NA	can be found by various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution	Akorn	NA	can be found by various suppliers
Vitrectomy 23G port	Alcon	Accurus systems
Vitrectomy machine	Alcon	Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle	Frimen	FT170206T