Subretinal transplantation av mänsklig embryonal stamcellsderiverad näthinnevävnad i en kattmodell för stora djur

Summary

Här presenteras en kirurgisk teknik för transplantation av human pluripotent stamcellsvävnad (hPSC)-härledd näthinnevävnad i subretinalutrymmet i en stordjursmodell.

Abstract

Retinal degenerativa (RD) tillstånd associerade med fotoreceptorförlust såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) och Leber medfödd amauros (LCA) orsakar progressiv och försvagande synförlust. Det finns ett ouppfyllt behov av terapier som kan återställa synen när fotoreceptorer har gått förlorade. Transplantation av human pluripotent stamcellsvävnad (hPSC)-härledd retinal vävnad (organoider) i det subretinala utrymmet i ett öga med avancerad RD ger retinala vävnadsark med tusentals friska mutationsfria fotoreceptorer och har potential att behandla de flesta/alla blindande sjukdomar associerade med fotoreceptordegeneration med ett godkänt protokoll. Transplantation av fetal näthinnevävnad i subretinalt utrymme hos djurmodeller och personer med avancerad RD har utvecklats framgångsrikt men kan inte användas som rutinbehandling på grund av etiska problem och begränsad vävnadsförsörjning. Stora ögonärvda retinal degeneration (IRD) djurmodeller är värdefulla för att utveckla synåterställningsterapier som använder avancerade kirurgiska metoder för att transplantera näthinneceller / vävnad i subretinalutrymmet. Likheterna i globstorlek och fotoreceptorfördelning (t.ex. närvaro av makulaliknande regionområdescentralis) och tillgängligheten av IRD-modeller som nära rekapitulerar human IRD skulle underlätta snabb översättning av en lovande terapi till kliniken. Här presenteras en kirurgisk teknik för att transplantera hPSC-härledd retinal vävnad i subretinalutrymmet i en stordjursmodell, vilket möjliggör bedömning av detta lovande tillvägagångssätt i djurmodeller.

Introduction

Miljontals människor runt om i världen påverkas av retinal degeneration (RD) med resulterande synnedsättning eller blindhet i samband med förlust av ljusavkännande fotoreceptorer (PR). Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är en viktig orsak till blindhet till följd av en kombination av genetiska riskfaktorer och miljö- / livsstilsfaktorer. Dessutom har över 200 gener och loci visat sig orsaka ärftlig RD (IRD)¹. Retinitis pigmentosa (RP), den vanligaste IRD, är genetiskt heterogen med mer än 3 000 genetiska mutationer i cirka 70 gener som rapporterats ^2,3,4. Leber medfödd amauros (LCA), som orsakar blindhet i barndomen är också genetiskt heterogen ^5,6. Genförstärkningsterapi har utvecklats och är i kliniska prövningar för behandling av ett litet antal IRD ^3,7. En separat terapi måste dock utvecklas för behandling av varje distinkt genetisk form av IRD och därmed endast behandling av en liten undergrupp av patienter. Dessutom är genförstoring beroende av närvaron av en population av räddningsbara fotoreceptorer och är därför inte tillämplig för avancerad degeneration.

Det finns därför ett brådskande och ännu ouppfyllt kliniskt behov av utveckling av terapier som adresserar och behandlar avancerade RD och djup till terminal blindhet. Under de senaste 2 decennierna har neuroprostetiska implantat utvecklats och testats i stora djurmodeller, såsom katten, före mänsklig användning 8,9,10,11,12,13,14. På samma sätt har retinala ersättningsterapier under de senaste 20 åren som använder ark av embryonal eller till och med mogen däggdjursnäthinna ympad subretinalt utvecklats 15,16,17,18,19,20,21,22 och till och med testats framgångsrikt hos RD-patienter ^23,24,25. Båda tillvägagångssätten använder idén att införa nya sensorer (fotovoltaiska kiselfotodioder i fallet med neuroprostetiska enheter^26,27 och friska mutationsfria fotoreceptorer organiserade i ark^, vid implantation av retinalark) i näthinnan med degenererade PR. Nyligen genomförda studier har undersökt användningen av stamcellsbaserade metoder såsom transplantation av humana pluripotenta stamceller (hPSC)-härledda retinala föregångare^28,29, hPSC-fotoreceptorer 30 och hPSC-retinala organoider^31,32,33. Retinala organoider möjliggör bildandet av retinal vävnad i en maträtt och härledning av fotoreceptorark med tusentals mutationsfria PR, som liknar fotoreceptorskiktet i den utvecklande mänskliga fosternäthinnan 34,35,36,37,38,39,40 . Transplantation av hPSC-härledd retinal vävnad (organoider) i subretinalutrymmet hos patienter med RD-tillstånd är en av de nya och lovande undersökningscellterapimetoderna, som eftersträvas av ett antal team 31,32,41,42. Jämfört med transplantation av cellsuspensionen (av unga fotoreceptorer eller retinala stamfäder) visade sig transplanterade ark av fetala fotoreceptorer resultera i synförbättringar i kliniska prövningar^23,24.

Protokollet som presenteras här beskriver i detalj ett transplantationsförfarande för subretinal leverans av hela retinala organoider (snarare än organoidfälgar^33,41) som ett potentiellt bättre sätt att införa intakta näthinneark med PR^, för att öka transplantatöverlevnaden och förbättra arkbevarandet. Även om procedurer för att införa en platt bit av mänsklig näthinna och även RPE-plåster har utvecklats^43,44,45, har transplantation av större 3D-transplantat inte undersökts. Stamcellshärledda retinala organoider ger en outtömlig källa till fotoreceptorark för att utveckla synåterställningsteknik, är fria från etiska begränsningar och anses vara en utmärkt källa till mänsklig näthinnevävnad för terapier som fokuserar på behandling av avancerad RD och terminal blindhet⁴⁶. Utveckling av kirurgiska metoder för exakt subretinal implantation av retinala organoider med minimal skada på värdens näthinnenisch (neural näthinna, retinal pigmentepitel och retinal och koroidal vaskulatur) är ett av de kritiska stegen för att utveckla sådan terapi mot kliniska tillämpningar^31,32. Stora djurmodeller som katter, hundar, grisar och apor har visat sig vara bra modeller för att undersöka kirurgiska leveransmetoder samt för att visa säkerheten hos implanterade vävnadsark (retinal pigmentepitel (RPE) celler) och undersöka användningen av organoider 41,44,45,47,48,49,50 . Det stora djurögat har en liknande klotstorlek som människa såväl som liknande anatomi inklusive närvaron av en region med hög fotoreceptordensitet, inklusive kottar (area centralis), som liknar den mänskliga makula 6,51,52.

I detta manuskript beskrivs en teknik för implantation av hPSC-härledd retinal vävnad (organoider) i subretinalutrymmet hos kattdjur stora djurmodeller (både vildtyp och Crx^{Rdy / +} katter), vilket tillsammans med lovande effektresultat^32,53 bygger en grund för vidareutveckling av sådan prövningsterapi mot kliniska tillämpningar för att behandla RD-tillstånd.

Protocol

Procedurerna utfördes i enlighet med Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalande för användning av djur i oftalmisk och synforskning. De godkändes också av Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee. Vildtyp och CrxRdy / + katter från en koloni av katter som underhålls vid Michigan State University användes i denna studie. Djuren hölls under 12 timmar: 12 timmar ljus-mörka cykler och matades med en kommersiell komplett kattdiet.</…

Representative Results

Denna procedur möjliggör framgångsrik och reproducerbar implantation av hPSC-härledda retinala organoider i subretinalutrymmet i en stor ögondjurmodell (demonstreras här med 2 exempel: vildtypskatter med friska fotoreceptorer (PR) och CrxRdy / + katter med degenererande PR och näthinna). Förbered och ladda hPSC-härledda retinala organoider med hjälp av stegen i injektionsanordningens borosilikatglaskanyl så att organoiderna inte skadas. Detta kan bekr?…

Discussion

Implantation av hPSC-härledd retinal vävnad (retinala organoider) i subretinalutrymmet är ett lovande experimentellt tillvägagångssätt för att återställa synen för sena retinala degenerativa sjukdomar orsakade av PR-celldöd (djup eller terminal blindhet). Det presenterade tillvägagångssättet bygger på en tidigare utvecklad och framgångsrikt testad experimentell terapi baserad på subretinal ympning av en bit mänsklig fetal näthinnevävnad^{23,24,25</sup…}

Materials

0.22 µm pore syringe filter with PES membrane	Cameo	NA	can be found by various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula	DORC	1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe	Hamilton	NA	can be found by various suppliers
6-0 Silk suture	Ethicon	707G
6-0/7-0 polyglactin suture	Ethicon	J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject)	Henry Schein Animal Health	NA	can be found by various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Par Pharmaceutical	NA	can be found by various suppliers
cSLO + SD-OCT	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine	Novartis	NA	can be found by various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium)	Vetone	NA	can be found by various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL	Cipla	NA	can be found by various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarnital solution)	Vortech	NA	can be found by various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL	Hospira	NA	can be found by various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing	World Precision Instruments	TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL	Pfizer	NA	can be found by various suppliers
Microscope	Zeiss	NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound)	Sakura	4583
Olympic Vac-Pac Size 23	Natus	NA	can be found by various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution	EMS	15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution	Akorn	NA	can be found by various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL	Akorn	NA	can be found by various suppliers
Propofol 5000mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28)	Zoetis	NA	can be found by various suppliers
RetCam II video fundus camera	Clarity Medical Systems	NA	can be found by various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40)	Bristol -Myers Squibb Company	NA	can be found by various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution	Akorn	NA	can be found by various suppliers
Vitrectomy 23G port	Alcon	Accurus systems
Vitrectomy machine	Alcon	Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle	Frimen	FT170206T