Ensaios da doença de podridão de raízes secas no grão-de-bico: uma metodologia detalhada
Summary
Este estudo apresenta metodologias para estudar os mecanismos pathomorfológicos e moleculares subjacentes à interação grão-de-bico-Rhizoctonia bataticola. O método de papel manchador é útil para estudar rapidamente as respostas do genótipo do grão-de-bico, enquanto o método adoecido à base de maconha pode ser usado para impor simultaneamente a seca e a infecção por R. bataticola e a tela para genótipos tolerantes.
Abstract
A doença da podridão de raízes secas (DRR) é uma ameaça emergente de estresse biótico ao cultivo de grão-de-bico em todo o mundo. É causada por um patógeno fúngico transportado pelo solo, Rhizoctonia bataticola. Na literatura, protocolos passo a passo abrangentes e detalhados sobre ensaios sobre doenças são escassos. Este artigo fornece detalhes completos sobre as etapas envolvidas na criação de uma técnica de papel manchador para triagem rápida de genótipos para resistência ao DRR. A técnica de papel manchador é fácil e menos cara. Outro método, baseado na abordagem do vaso doente, é uma imitação de infecção natural e pode ser aplicado para estudar os componentes que interagem — planta, patógeno e ambiente — envolvidos no triângulo da doença.
Além disso, na natureza, a DRR ocorre principalmente em áreas de cultivo de grão-de-bico-de-bico-de-chuva, onde a umidade do solo recua à medida que o crescimento das culturas avança. O estresse da seca é conhecido por predispor plantas de grão-de-bico à doença drr. A compreensão patomorfológica e molecular da interação planta-patógeno sob o estresse da seca pode abrir caminho para a identificação de variedades resistentes à DRR de elite da piscina de germoplasma de grão-de-bico. Este artigo fornece uma metodologia stepwise para a preparação de um pote doente e ensaio subsequente da doença. No geral, as informações aqui apresentadas ajudarão os pesquisadores a preparar o inóculo fúngico R. bataticola, manter esse patógeno, configurar a técnica de papel manchador, preparar a cultura doente e o pote doente e avaliar a infecção por patógenos em plantas de grão-de-bico.
Introduction
A podridão de raízes secas (DRR) é uma das doenças economicamente significativas no grão-de-bico1,2. É uma doença específica da raiz causada pela Rizoctonia bataticola (teleomorfo, macrofomina phaseolina). As plantas infectadas não possuem raízes laterais e possuem raízes de torneiras frágeis e folhagens amarelas1,3. DrR sob estresse de seca tem sido relatado como uma ameaça emergente ao cultivo de grão-de-bico1,2,3. Além disso, a incidência de DRR é relatada como agravada sob o estresse da seca sob as condições de campo1,2,3. DrR é mais prevalente em áreas de chuva do que em campos irrigados4. A utilização de variedades resistentes é a forma de superar a doença e contornar o uso de fungicidas1,13. Como o germoplasma do grão-de-bico disponível em todo o mundo abriga variação genética para o traço5,a triagem e identificação de genótipos resistentes/suscetíveis são fundamentais para a reprodução molecular para melhoria da cultura.
Ensaios robustos, fáceis e econômicos para doenças são essenciais para investigar padrões de infecção por R. bataticola no grão-de-bico. O ensaio da doença primária utilizado para observar a resposta dos genótipos de grão-de-bico à infecção por R. bataticola é a técnica de papel manchador1,4. É uma técnica simples e pode ser executada usando inóculo fúngico líquido, mudas com raízes e papel estéril. No entanto, essa técnica não foi utilizada ao máximo porque não há protocolo passo a passo disponível na literatura.
Enquanto isso, a técnica de maconha doente envolve a preparação de uma cultura doentia potencial e a imposição do estresse da seca. Dado que o estresse da seca agrava a incidência da doençade DRR 3,é essencial estudar a interação planta-patógeno sob o estresse da seca6,7. A técnica de vaso doente fornece a plataforma para um estudo tão simultâneo, promovendo melhores possibilidades de triagem de germoplasma e compreensão da base mecanicista da interação. Alterações pathomorfológicas, como aumento do comprimento da raiz e redução do número de raízes laterais — inerentes à doença drr — podem ser tratadas usando a técnica de vaso doente1,3,7.
Aqui, é apresentado um protocolo detalhado para o papel manchador e técnicas de maconha doente, que podem ser utilizados para estudar a interação entre grão-de-bico e R. bataticola e germoplasma de grão-de-bico de tela. Os detalhes dos materiais utilizados no estudo são dados na Tabela de Materiais.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica de papel manchador fornece uma abordagem simples para tela genótipos de grão-de-bico em condições laboratoriais. A inoculação de mergulho permite a investigação da interação em uma base temporal com fácil controle sobre a carga inóculo(Figura Suplementar 1) e facilita a triagem in vitro. Além disso, até mesmo mudas jovens podem ser usadas. A cultura fúngica de cinco dias de idade(Figura 1B) pode produzir inóculo suficiente para infectar as plantas….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os projetos do laboratório M.S.K são apoiados pelo Instituto Nacional de Pesquisa de Genoma vegetal. VI reconhece DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Agradecemos aos estudantes estagiários, Srta. Rishika, Sr. Jayachendrayan, e Miss Durgadevi por ajuda técnica durante a filmagem e o Sr. Sandeep Dixit, Miss. Anjali e Dr. Avanish Rai por avaliar criticamente os dados brutos e os arquivos do manuscrito. Agradecemos ao Sr. Rahim H Tarafdar e ao Sr. Sunder Solanki pela ajuda no laboratório. Reconhecemos o DBT-eLibrary Consortium (DeLCON) e a BIBLIOTECA NIPGR por fornecer acesso a recursos eletrônicos e instalações de crescimento de plantas NIPGR para suporte/espaço de crescimento de plantas.
Materials
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
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