Test della malattia del marciume delle radici secche nei ceci: una metodologia dettagliata
Summary
Questo studio presenta metodologie per studiare i meccanismi patologici e molecolari alla base dell’interazionececi- Rhizoctonia bataticola. Il metodo della carta assorbente è utile per studiare rapidamente le risposte al genotipo dei ceci, mentre il metodo malato a base di vaso può essere utilizzato per imporre contemporaneamente siccità e infezione da R. bataticola e schermo per genotipi tolleranti.
Abstract
La malattia del marciume delle radici secche (DRR) è una minaccia emergente di stress biotico per la coltivazione di ceci in tutto il mondo. È causato da un agente patogeno fungino trasportato dal suolo, Rhizoctonia bataticola. In letteratura, i protocolli completi e dettagliati passo dopo passo sui test delle malattie sono scarsi. Questo articolo fornisce dettagli completi sui passaggi necessari per impostare una tecnica di carta assorbente per vagliare rapidamente i genotipi per la resistenza alla DRR. La tecnica della carta assorbente è facile e meno costosa. Un altro metodo, basato sull’approccio del vaso malato, è un imitatore dell’infezione naturale e può essere applicato per studiare i componenti interagenti – pianta, patogeno e ambiente – coinvolti nel triangolo della malattia.
Inoltre, in natura, la DRR si verifica principalmente nelle aree di coltivazione dei ceci piovosi, dove l’umidità del suolo si allontana con l’avanzare della crescita delle colture. Lo stress da siccità è noto per predisporre le piante di ceci alla malattia DRR. La comprensione patomorfologica e molecolare dell’interazione pianta-patogeno sotto stress da siccità può spianare la strada all’identificazione di varietà resistenti alla DRR d’élite dal pool di germoplasma ceci. Questo articolo fornisce una metodologia graduale per la preparazione di un vaso malato e il successivo saggio di malattia. Nel complesso, le informazioni qui presentate aiuteranno i ricercatori a preparare l’inoculo fungino R. bataticola, mantenere questo agente patogeno, impostare la tecnica della carta assorbente, preparare la coltura malata e il vaso malato e valutare l’infezione da agenti patogeni nelle piante di ceci.
Introduction
Il marciume della radice secca (DRR) è una delle malattie economicamente significative nelceci 1,2. È una malattia specifica della radice causata da Rhizoctonia bataticola (teleomorfo, Macrophomina phaseolina). Le piante infette mancano di radici laterali e possiedono radici di rubinetto fragili e fogliamegiallo 1,3. Drr sotto stress da siccità è stato segnalato come una minaccia emergente per la coltivazione diceci 1,2,3. Inoltre, si dice che l’incidenza della DRR sia aggravata dallo stress da siccità nellecondizioni di campo 1,2,3. La DRR è più diffusa nelle aree piovose che nei campi irrigati4. L’utilizzo di varietà resistenti è il modo per superare la malattia ed aggirare l’uso difungicidi 1,13. Poiché il germoplasma di ceci disponibile in tutto il mondo ospita variazioni genetiche per il tratto5, lo screening e l’identificazione di genotipi resistenti / sensibili sono fondamentali per l’allevamento molecolare per il miglioramento delle colture.
Test di malattia robusti, facili ed efficaci in termini di costi sono essenziali per indagare i modelli di infezione da R. bataticola nei ceci. Il test della malattia primaria utilizzato per osservare la risposta dei genotipi di ceci all’infezione da R. bataticola è la tecnica della cartaassorbente 1,4. È una tecnica semplice e può essere eseguita utilizzando inoculo fungino liquido, piantine con radici e carta assorbente sterile. Tuttavia, questa tecnica non è stata utilizzata al massimo perché non è disponibile alcun protocollo passo-passo in letteratura.
Nel frattempo, la tecnica del vaso malato prevede la preparazione di una potenziale cultura malata e l’imposizione dello stress da siccità. Dato che lo stress da siccità aggrava l’incidenza della malattia DRR3, è essenziale studiare l’interazione pianta-patogeno sotto lo stress dasiccità 6,7. La tecnica del vaso malato fornisce la piattaforma per uno studio così simultaneo, promuovendo migliori possibilità per lo screening del germoplasma e comprendendo le basi meccaniche dell’interazione. I cambiamenti patologici, ad esempio l’aumento della lunghezza delle radici e la riduzione del numero di radici laterale, inerenti alla malattia DRR, possono essere affrontati utilizzando la tecnica delvaso malato 1,3,7.
Qui viene presentato un protocollo dettagliato per la carta assorbente e le tecniche di pentola malata, che può essere utilizzato per studiare l’interazione tra ceci e R. bataticola e germplasma di ceci dello schermo. I dettagli dei materiali utilizzati nello studio sono riportati nella tabella dei materiali.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica della carta assorbente fornisce un approccio diretto ai genotipi di ceci dello schermo in condizioni di laboratorio. L’inoculazione a immersione consente lo studio dell’interazione su base temporale con un facile controllo del carico di inoculo(figura complementare 1)e facilita lo screening in vitro. Inoltre, possono essere utilizzate anche giovani piantine. La coltura fungina di cinque giorni(figura 1B)può produrre abbastanza inoculo da infettare le piante. L’in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I progetti del laboratorio M.S.K sono supportati dal finanziamento principale del National Institute of Plant Genome Research. VI riconosce DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Ringraziamo gli studenti tirocinanti, miss Rishika, Jayachendrayan e Miss Durgadevi per l’aiuto tecnico durante le riprese video e il signor Sandeep Dixit, la signorina Anjali e il dottor Avanish Rai per aver valutato criticamente i dati grezzi e i file manoscritti. Ringraziamo il signor Rahim H Tarafdar e il signor Sunder Solanki per il loro aiuto in laboratorio. Riconosciamo il Consorzio DBT-eLibrary (DeLCON) e la Biblioteca NIPGR per aver fornito l’accesso alle risorse e-resources e al NIPGR Plant Growth Facility per il supporto /spazio per la crescita degli impianti.
Materials
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
References
- Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea – where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
- Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
- Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
- Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
- Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
- Agrios, G. . Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
- Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
- Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. . Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
- Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
