Samtidig Live Imaging af flere insekt embryoner i Sample Kammer-baserede Light Sheet Fluorescens Mikroskoper
Summary
Lysarkbaseret fluorescensmikroskopi er det mest værdifulde værktøj inden for udviklingsbiologi. Et vigtigt spørgsmål i sammenlignende undersøgelser er variansen i omgivelserne. Vores protokol beskriver en eksperimentel ramme for samtidig live billeddannelse af flere prøver og behandler derfor dette problem proaktivt.
Abstract
Lysarkbaseret fluorescensmikroskopi tilbyder effektive løsninger til at studere komplekse processer på flere biologisk relevante skalaer. Prøvekammerbaserede opsætninger, der er specielt designet til at bevare prøvens tredimensionelle integritet og normalt har prøverotation, er det bedste valg inden for udviklingsbiologi. For eksempel er de blevet brugt til at dokumentere hele den embryonale morfogenese af frugtfluen Drosophila melanogaster og den røde melbille Tribolium castaneum. Mange tilgængelige protokoller for levende billeddannelse giver dog kun eksperimentelle rammer for enkelte embryoner. Især for sammenlignende undersøgelser er sådanne tilgange ubelejlige, da sekventielt afbildede prøver påvirkes af omgivende varians. Desuden begrænser dette antallet af prøver, der kan analyseres inden for en given tid. Vi tilbyder en eksperimentel ramme for samtidig live billeddannelse, der øger gennemstrømningen i prøvekammerbaserede opsætninger og dermed sikrer lignende omgivende forhold for alle prøver. For det første giver vi en kalibreringsretningslinje for lysark fluorescensmikroskoper. For det andet foreslår vi en monteringsmetode for flere embryoner, der er forenelig med prøverotation. For det tredje leverer vi eksemplariske tredimensionelle live imaging datasæt af Drosophila, som vi sidestiller tre transgene linjer med fluorescerende mærket kerner, såvel som af Tribolium, for hvilke vi sammenligner udførelsen af tre transgene underlinjer, der bærer den samme transgener, men på forskellige genomiske steder. Vores protokol er specielt designet til sammenlignende undersøgelser, da den proaktivt adresserer omgivende varians, som altid er til stede i sekventiel live billeddannelse. Dette er især vigtigt for kvantitative analyser og karakterisering af aberrationelle fænotyper, som f.eks. Desuden øger det den samlede gennemløb, hvilket er meget bekvemt, når adgangen til lysark fluorescens mikroskoper er begrænset. Endelig kan den foreslåede monteringsmetode tilpasses andre insektarter og yderligere modelorganismer, f.eks.
Introduction
Fluorescensmikroskopi er en af de mest essentielle billeddannelsesteknikker inden for biovidenskab, især i celle- og udviklingsbiologi. I confocal fluorescens mikroskoper1, som er state-of-the-art for tre-dimensionelle fluorescens billeddannelse siden midten af 1990’erne, den samme linse bruges til fluorophore excitation og emission lys afsløring. Belysningslaserstrålen ophidser alle fluorophorer langs belysnings-/detektionsaksen, og det respektive signal uden for fokus skelnes, inden det registreres af et pinhole. Derfor er hele prøven for hvert todimensionelt billede belyst. Derfor, for hver tre-dimensionelle billede, dvs en stak rumligt fortløbende to-dimensionelle billeder, hele prøven er belyst flere dusin til et par hundrede gange2, som fremmer photobleaching og fototoksicitet3.
For næsten tyve år siden fremstod lysarkbaseret teknologi4 som et lovende alternativ til tredimensionel fluorescensbilleddannelse og blev dermed et værdifuldt værktøj i udviklingsbiologi5. I denne tilgang afkobles belysning og detektion. Belysningslinsen bruges til at generere et lysark med en dybde på kun få mikrometer inden for brændplanet for den vinkelret arrangerede detektionslinse. Derfor er der for hvert todimensionelt billede kun et tyndt planarvolumen omkring brændplanet, der belyses. Derfor belyses hele prøven kun én gang for hvert tredimensionelt billede, hvilket stærkt reducerer fotobleaching og fototoksicitet6. Af denne grund tilbyder lysplade fluorescensmikroskoper (LSFMs) effektive løsninger til at studere komplekse processer på flere biologisk relevante skalaer og er derfor af særlig værdi i udviklingsbiologi, hvor prøver så store som flere millimeter skal analyseres på subcellulært niveau.
Historisk set har LSFMs været prøve kammer-baserede7,8. I disse opsætninger er belysnings- (x) og detektionsakserne (z) normalt arrangeret vinkelret på tyngdekraftsaksen (y). Prøvekamre giver rigelig eksperimentel frihed. For det første giver de en stor billedbufferkapacitet, hvilket igen letter brugen af et perfusionssystem til at kontrollere miljøet, f.eks. Desuden understøtter de tilpassede monteringsmetoder10, der er skræddersyet til de respektive eksperimentelle behov, samtidig med at de bevarer prøvens tredimensionelle, i nogle tilfælde dynamiske11, integritet. Derudover er prøvekammerbaserede opsætninger normalt udstyret med en rotationsfunktion, der bruges til at dreje prøverne omkring y-aksen og dermed afbilde dem langs to, fire eller endnu flere retninger. Da embryoner af almindeligt anvendte modelorganismer i forbindelse med mikroskopi er relativt store, giver successive billeder langs ventral-dorsale, laterale og/eller forreste bageste kropsakser en mere omfattende repræsentation. Dette giver f.eks. mulighed for langsigtet sporing af celler, der bevæger sig langs komplekse tredimensionale overflytningsstier12,13.
Lysarkbaseret fluorescensmikroskopi er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere Drosophila melanogastersembryonale morfose , både systematisk14,15 samt med et specifikt fokus på de biofysiske aspekter af udvikling. For eksempel blev det brugt til at indsamle morfogenetiske data i høj opløsning for at opdage en biomekanisk forbindelse mellem endoderm invagination og akseudvidelse under kimbåndsforlængelse16 og yderligere for at relatere det komplekse cellulære flow med kraftgenereringsmønstre under gastrulation17. Det er også blevet kombineret med andre state-of-the-art teknikker, f.eks optogenetics at undersøge reguleringen af Wnt signalering under forreste-posterior mønstre i epidermis18.
Men at studere kun en art giver ikke indsigt i udviklingen af udviklingen. For at forstå embryogenese i den fylogenetiske kontekst er der udført intensiv forskning med alternative insektmodelorganismer. En af de mest omfattende undersøgte arter er den røde melbille Tribolium castaneum, et økonomisk relevant opbevaret korn skadedyr19, hvis embryonale morfogenese også allerede er blevet systematisk afbildet med LSFM20. Den embryonale morfogenese af disse to arter adskiller sig bemærkelsesværdigt i flere aspekter,f.eks. Sidstnævnte aspekt er allerede blevet grundigt analyseret ved hjælp af LSFMs. For eksempel har det vist sig, at serosa, et ekstra embryonalt væv, der omslutter og beskytter Tribolium-embryoet mod forskellige farer for det meste af dets embryogenese23,24, også fungerer som den morfogenetiske “driver” til sin egen tilbagetrækningsproces under dorsal lukning25. Endvidere er det blevet påvist, at en bestemt region af blastoderm under gastrulation forbliver forankret i vitellinemembranen for at skabe asymmetriske vævsbevægelser26 og efter denne observation, at regionaliseret vævsvæske gør det muligt for celler at sekventielt forlade serosakanten under serosavinduelukning27.
I alle ovennævnte Drosophila-og Tribolium-relateredeundersøgelser er der anvendt prøvekammerbaserede LSFMs. I de fleste blev embryonerne registreret i flere retninger ved hjælp af prøverotationsfunktionen. Selvom det ikke udtrykkeligt er angivet, kan det antages, at de er blevet registreret individuelt og dermed uafhængige af hinanden i sekventielle live billedanalyseanalyser, svarende til vores tidligere arbejde med Tribolium20,28. I visse scenarier er en sådan fremgangsmåde acceptabel, men især i kvantitative komparative tilgange kan variansen fordreje resultaterne. For eksempel har det længe været kendt, at insekternes udviklingshastighed er temperaturafhængig29, men en nyere undersøgelse tyder yderligere på, at temperaturen i Drosophilaogså kan påvirke koncentrationen af morfogener30. Hvis visse karakteristika ved embryogenese, f.eks. Dette minimerer standardafvigelser og standardfejl, hvilket igen letter sammenstilling med andre, selv bare marginalt divergerende eksperimentelle forhold.
Prøvekammerbaserede LSFM’er er dog primært designet til højt indhold i stedet for høje gennemløbsanalyser. I modsætning til konfokale mikroskoper, som typisk er udstyret med standardiserede klemmemekanismer til mikroskopidias, petriskåle og brøndplader, bruger næsten alle prøvekammerbaserede LSFM’er cylinderbaserede klemmemekanismer. Disse mekanismer er beregnet til specialfremstillede prøveholdere , der er rotationskompatible såvel som ikke-invasive10, men som normalt ikke er designet til mere end én prøve20,31,32. En ramme for samtidig levende billeddannelse af to eller flere embryoner, hvor fordelene ved prøvekammerbaserede opsætninger ikke kompromitteres, tager fat på spørgsmålet om omgivende varians og øger dermed værdien af LSFM’er til sammenlignende undersøgelser.
I vores protokol præsenterer vi en eksperimentel ramme for sammenlignende levende billeddannelse i prøvekammerbaserede LSFM’er (Figur 1A), hvor y-aksen bruges som en mulighed for at “stable” embryoner. For det første leverer vi en fluorescerende mikrosfærebaseret kalibreringsretningslinje for prøvekammerbaserede LSFM’er, hvilket er særligt vigtigt for instrumenter, der mangler en kalibreringsassistent. For det andet beskriver vi en monteringsmetode for flere embryoner baseret på spindelvævsholderen28 (Figur 1B),der er kompatibel med prøverotation og dermed giver mulighed for samtidig billeddannelse af flere prøver langs flere retninger (Figur 1C). Flere embryoner er justeret oven på en tynd agarosefilm og flyttede efter indsættelse i prøvekammeret successivt gennem lysarket for at erhverve tredimensionelle billeder. For det tredje leverer vi tre eksemplariske live billeddatasæt til Drosophila såvel som til Tribolium. For førstnævnte sidestiller vi transgene linjer med fluorescerende mærkede kerner. For sidstnævnte sammenligner vi ydeevnen af transgene underlinjer, der bærer den samme transgen, men på forskellige genomiske steder. Endelig diskuterer vi betydningen af parallelisering med hensyn til sammenlignende levende billeddannelse og omgivende varians33, diskuterer gennemløbsgrænsen for vores eksperimentelle ramme og evaluerer tilpasningen af vores tilgang til andre modelorganismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et af LSFMs eksklusive anvendelsesområder er udviklingsbiologi. I denne disciplin er det vigtigt at se på levende prøver, ellers kan morfogenetiske processer ikke beskrives på en dynamisk måde. En eksperimentel ramme for den samtidige levende billeddannelse i prøvekammerbaserede LSFM’er, som beskrevet her, er praktisk af to hovedårsager.
Omgivende varians, som er uundgåelig i sekventiel live billeddannelse, kan behandles proaktivt. I insektfoster-associeret levende billeddannelse ser v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Ernst H. K. Stelzer for muligheden for at bruge hans ressourcer samt hans værdifulde kommentarer vedrørende manuskriptet, Anita Anderl for støtte med Tribolium live imaging, Sven Plath for teknisk support samt Ilan Davis, Nicole Grieder og Gerold Schubiger for at dele deres transgene Drosophila linjer via Bloomington Stock Center.
Materials
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100-µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | Only for live imaging involving Tribolium |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
References
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
- Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
- Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
- Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
- El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
- Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
- Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
- Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
- Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
- Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
- Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
- Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
- Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
- Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
- Mcdonald, J. H. . Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , (2013).
- Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
- Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
- Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
- Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
- He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
- Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
- Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , (1997).
- Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
- McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
- Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
- Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
- Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
- Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).
