Imágenes simultáneas en vivo de múltiples embriones de insectos en microscopios de fluorescencia de hoja de luz basados en cámaras de muestra
Summary
La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz es la herramienta más valiosa en biología del desarrollo. Un problema importante en los estudios comparativos es la varianza ambiental. Nuestro protocolo describe un marco experimental para la proyección de imagen viva simultánea de especímenes múltiples y, por lo tanto, trata este problema favorablemente activamente.
Abstract
La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz ofrece soluciones eficientes para estudiar procesos complejos en múltiples escalas biológicamente relevantes. Las configuraciones basadas en cámaras de muestras, que están diseñadas específicamente para preservar la integridad tridimensional de la muestra y generalmente cuentan con rotación de muestras, son la mejor opción en biología del desarrollo. Por ejemplo, se han utilizado para documentar toda la morfogénesis embrionaria de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y el escarabajo de la harina roja Tribolium castaneum. Sin embargo, muchos protocolos de imágenes en vivo disponibles proporcionan solo marcos experimentales para embriones individuales. Especialmente para los estudios comparativos, tales enfoques son inconvenientes, ya que las muestras con imágenes secuenciales se ven afectadas por la varianza ambiental. Además, esto limita el número de especímenes que se pueden ensayado dentro de un tiempo determinado. Proporcionamos un marco experimental para imágenes simultáneas en vivo que aumenta el rendimiento en configuraciones basadas en cámaras de muestras y, por lo tanto, garantiza condiciones ambientales similares para todas las muestras. En primer lugar, proporcionamos una guía de calibración para microscopios de fluorescencia de láminas de luz. En segundo lugar, proponemos un método de montaje para múltiples embriones que sea compatible con la rotación de muestras. En tercer lugar, proporcionamos conjuntos de datos de imágenes en vivo tridimensionales ejemplares de Drosophila,para lo cual yuxtaponemos tres líneas transgénicas con núcleos marcados fluorescentemente, así como de Tribolium,para lo cual comparamos el rendimiento de tres sublíneas transgénicas que llevan el mismo transgén, pero en diferentes ubicaciones genómicas. Nuestro protocolo está diseñado específicamente para estudios comparativos, ya que aborda de forma proactiva la varianza ambiental, que siempre está presente en las imágenes en vivo secuenciales. Esto es especialmente importante para los análisis cuantitativos y la caracterización de fenotipos aberrantes, que resultan, por ejemplo, de experimentos knockout. Además, aumenta el rendimiento general, lo que es muy conveniente cuando el acceso a los microscopios de fluorescencia de láminas de luz es limitado. Finalmente, el método de montaje propuesto se puede adaptar para otras especies de insectos y otros organismos modelo, por ejemplo, el pez cebra, básicamente sin esfuerzo de optimización.
Introduction
La microscopía de fluorescencia es una de las técnicas de imagen más esenciales en las ciencias de la vida, especialmente en biología celular y del desarrollo. En los microscopios de fluorescencia confocal1,que son de última generación para imágenes de fluorescencia tridimensionales desde mediados de la década de 1990, la misma lente se utiliza para la excitación de fluoróforos y la detección de luz de emisión. El rayo láser de iluminación excita todos los fluoróforos a lo largo del eje de iluminación/detección y la señal de desfoque respectiva se discrimina antes de la detección por un agujero de alfiler. Por lo tanto, para cada imagen bidimensional, se ilumina todo el espécimen. En consecuencia, para cada imagen tridimensional, es decir, una pila de imágenes bidimensionales espacialmente consecutivas, todo el espécimen se ilumina varias docenas a unos pocos cientos de veces2,lo que promueve el fotoblanqueo y la fototoxicidad3.
Hace casi veinte años, la tecnología basada en láminas de luz4 surgió como una alternativa prometedora para las imágenes tridimensionales de fluorescencia y, por lo tanto, se convirtió en una herramienta valiosa en la biología del desarrollo5. En este enfoque, la iluminación y la detección están desacopladas. La lente de iluminación se utiliza para generar una hoja de luz con una profundidad de sólo unos pocos micrómetros dentro del plano focal de la lente de detección dispuesta perpendicularmente. Por lo tanto, para cada imagen bidimensional, solo se ilumina un volumen plano delgado alrededor del plano focal. En consecuencia, para cada imagen tridimensional, todo el espécimen se ilumina una sola vez, lo que disminuye fuertemente el fotoblanqueo y la fototoxicidad6. Por esta razón, los microscopios de fluorescencia de láminas de luz (LSFMs) ofrecen soluciones eficientes para estudiar procesos complejos en múltiples escalas biológicamente relevantes y son, por lo tanto, de particular valor en biología del desarrollo, donde especímenes tan grandes como varios milímetros tienen que ser analizados a nivel subcelular.
Históricamente, los LSFMs han sido de muestra basados encámaras 7,8. En estas configuraciones, los ejes de iluminación (x) y detección (z) generalmente se organizan perpendicularmente al eje de gravedad (y). Las cámaras de muestras ofrecen una amplia libertad experimental. En primer lugar, proporcionan grandes capacidades de tampón de imágenes, lo que a su vez facilita el uso de un sistema de perfusión para controlar el medio ambiente, por ejemplo, para mantener una temperatura específica9 o para aplicar estresores bioquímicos. Además, admiten métodos de montaje personalizados10 que se adaptan a las respectivas necesidades experimentales, preservando al mismo tiempo la integridad tridimensional, en algunos casos dinámica11,de la muestra. Además, las configuraciones basadas en cámaras de muestra generalmente están equipadas con una función de rotación que se utiliza para girar las muestras alrededor del eje y y, por lo tanto, obtener imágenes a lo largo de dos, cuatro o incluso más direcciones. Puesto que los embriones de organismos modelo de uso general son, en el contexto de microscopia, relativamente grandes, la proyección de imagen sucesiva a lo largo de las hachas ventral-dorsales, laterales, y/o anterior-posteriores del cuerpo proporciona una representación más comprensiva. Esto permite, por ejemplo, el seguimiento a largo plazo de las células que se mueven a lo largo de complejas rutas de migracióntridimensionales 12,13.
La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz se ha aplicado ampliamente para estudiar la morfogénesis embrionaria de Drosophila melanogaster,tanto sistemáticamente14,15 como con un enfoque específico en los aspectos biofísicos del desarrollo. Por ejemplo, se utilizó para recopilar datos morfogenéticos de alta resolución con el fin de detectar un vínculo biomecánico entre la invaginación del endodermo y la extensión del eje durante el alargamiento de la banda germinal16 y, además, para relacionar el flujo celular complejo con los patrones de generación de fuerza durante la gastrulación17. También se ha combinado con otras técnicas de vanguardia, por ejemplo, optogenética para investigar la regulación de la señalización de Wnt durante el patrón anterior-posterior en la epidermis18.
Sin embargo, el estudio de una sola especie no proporciona información sobre la evolución del desarrollo. Para comprender la embriogénesis dentro del contexto filogenético, se ha llevado a cabo una investigación intensiva con organismos modelo de insectos alternativos. Una de las especies más investigadas es el escarabajo de la harina roja Tribolium castaneum,una plaga de grano almacenado económicamente relevante19,cuya morfogénesis embrionaria también ha sido sistemáticamente fotoizada con LSFM20. La morfogénesis embrionaria de estas dos especies difiere notablemente en varios aspectos, por ejemplo, el modo de segmentación21,así como la formación y degradación de membranas extraembrionarias22. Este último aspecto ya ha sido ampliamente analizado utilizando LSFMs. Por ejemplo, se ha demostrado que la serosa, un tejido extraembrionario que envuelve y protege al embrión de Tribolium de diversos peligros para la mayor parte de su embriogénesis23,24,también actúa como el “conductor” morfogenético para su propio proceso de retirada durante el cierre dorsal25. Además, se ha demostrado que durante la gastrulación, una región particular del blastodermo permanece anclada a la membrana vitelina para crear movimientos tisulares asimétricos26 y, tras esta observación, que la fluidización tisular regionalizada permite a las células salir secuencialmente del borde de la serosa durante el cierre de la ventana de la Serosa27.
En todos los estudios asociados a Drosophilay Triboliumcitados anteriormente, se han utilizado LSFMs basados en cámaras de muestra. En la mayoría, los embriones se registraron a lo largo de múltiples direcciones utilizando la función de rotación de la muestra. Aunque no se indica explícitamente, se puede suponer que se han registrado individualmente y, por lo tanto, independientes entre sí en ensayos secuenciales de imágenes en vivo, similar a nuestro trabajo anterior en Tribolium20,28. En ciertos escenarios, tal enfoque es aceptable, pero especialmente en los enfoques comparativos cuantitativos, la varianza ambiental puede distorsionar los resultados. Por ejemplo, desde hace mucho tiempo se sabe que la velocidad de desarrollo de los insectos depende de la temperatura29,pero un estudio más reciente sugiere además que en Drosophila,la temperatura también puede afectar la concentración de morfógenos30. En consecuencia, si ciertas características de la embriogénesis, por ejemplo, las proporciones dinámicas, las tasas de división y las velocidades de migración de las células, deben cuantificarse con precisión, se requieren suficientes repeticiones sin varianza ambiental. Esto minimiza las desviaciones estándar y los errores estándar, lo que a su vez facilita la yuxtaposición con otras condiciones experimentales, incluso marginalmente divergentes.
Sin embargo, los LSFMs basados en cámaras de muestras están diseñados principalmente para ensayos de alto contenido en lugar de ensayos de alto rendimiento. A diferencia de los microscopios confocales, que normalmente están equipados con mecanismos de abrazadera estandarizados para portaobjetos de microscopía, placas de Petri y placas de pozos, casi todos los LSFMs basados en cámaras de muestras utilizan mecanismos de abrazadera basados en cilindros. Estos mecanismos están destinados a portamuebadores de muestras a medida que son compatibles con la rotación, así como no invasivos10,pero por lo general no diseñados para más de una muestra20,31,32. Un marco para la obtención simultánea de imágenes en vivo de dos o más embriones, en el que las ventajas de las configuraciones basadas en cámaras de muestras no se ven comprometidas, aborda el problema de la varianza ambiental, lo que aumenta el valor de los LSFMs para estudios comparativos.
En nuestro protocolo, presentamos un marco experimental para la proyección de imagen viva comparativa en LSFMs cámara-basada de la muestra(figura 1A)en el cual el eje de y se utiliza como opción para “apilar” embriones. En primer lugar, proporcionamos una guía de calibración fluorescente basada en microesfera para LSFMs basados en cámaras de muestras, que es especialmente importante para los instrumentos que carecen de un asistente de calibración. En segundo lugar, describimos un método de montaje para múltiples embriones basado en el soporte de telaraña28 (Figura 1B)que es compatible con la rotación de la muestra y, por lo tanto, permite la obtención simultánea de imágenes de múltiples especímenes a lo largo de múltiples direcciones(Figura 1C). Varios embriones se alinean en la parte superior de una fina película de agarosa y, después de la inserción en la cámara de muestra, se mueven sucesivamente a través de la lámina de luz para adquirir imágenes tridimensionales. En tercer lugar, proporcionamos tres conjuntos de datos de imágenes en vivo ejemplares para Drosophila, así como para Tribolium. Para los primeros, yuxtaponemos líneas transgénicas con núcleos marcados fluorescentemente. Para este último, comparamos el rendimiento de las sublíneas transgénicas que llevan el mismo transgén, pero en diferentes ubicaciones genómicas. Finalmente, discutimos la importancia de la paralelización con respecto a la proyección de imagen viva comparativa y la variación ambiente33,debatimos el límite de rendimiento de nuestro marco experimental y evaluamos la adaptación de nuestro enfoque a otros organismos modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una de las áreas de aplicación exclusivas de LSFMs es la biología del desarrollo. En esta disciplina, es importante observar especímenes vivos, de lo contrario los procesos morfogenéticos no se pueden describir de manera dinámica. Un marco experimental para la proyección de imagen viva simultánea en LSFMs cámara-basados de la muestra, según lo descrito aquí, es conveniente por dos razones principales.
La varianza ambiental, que es inevitable en imágenes en vivo secuenciales, se pue…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Ernst H. K. Stelzer por la oportunidad de utilizar sus recursos, así como sus valiosos comentarios sobre el manuscrito, Anita Anderl por su apoyo con las imágenes en vivo de Tribolium, Sven Plath por el apoyo técnico, así como a Ilan Davis, Nicole Grieder y Gerold Schubiger por compartir sus líneas transgénicas de Drosophila a través del Bloomington Stock Center.
Materials
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100-µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | Only for live imaging involving Tribolium |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
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