नमूना कक्ष आधारित प्रकाश शीट फ्लोरेसेप्स माइक्रोस्कोप में कई कीट भ्रूण की एक साथ लाइव इमेजिंग
Summary
प्रकाश पत्रक आधारित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विकासात्मक जीव विज्ञान में सबसे मूल्यवान उपकरण है। तुलनात्मक अध्ययनों में एक प्रमुख मुद्दा परिवेश विचरण है । हमारा प्रोटोकॉल कई नमूनों के एक साथ लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रयोगात्मक ढांचे का वर्णन करता है और इसलिए, इस मुद्दे को सक्रिय रूप से संबोधित करता है।
Abstract
लाइट शीट-आधारित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी कई जैविक रूप से प्रासंगिक पैमानों पर जटिल प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कुशल समाधान प्रदान करता है। नमूना कक्ष आधारित सेटअप, जो विशेष रूप से नमूने की त्रि-आयामी अखंडता को संरक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं और आमतौर पर नमूना रोटेशन की सुविधा देते हैं, विकासात्मक जीव विज्ञान में सबसे अच्छा विकल्प हैं। उदाहरण के लिए, उनका उपयोग फल फ्लाई ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर और लाल आटा बीटल ट्राइबोलियम कास्टेनियमके पूरे भ्रूणरूपेसिस को दस्तावेज करने के लिए किया गया है। हालांकि, कई उपलब्ध लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल एकल भ्रूण के लिए केवल प्रायोगिक ढांचे प्रदान करते हैं। विशेष रूप से तुलनात्मक अध्ययनों के लिए, ऐसे दृष्टिकोण असुविधाजनक हैं, क्योंकि क्रमिक रूप से चित्रित नमूने परिवेश विचरण से प्रभावित होते हैं। इसके अलावा, यह उन नमूनों की संख्या को सीमित करता है जिन्हें एक निर्धारित समय के भीतर परखा जा सकता है। हम एक साथ लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रयोगात्मक ढांचा प्रदान करते हैं जो नमूना कक्ष-आधारित सेटअप में थ्रूपुट को बढ़ाता है और इस प्रकार सभी नमूनों के लिए समान परिवेश की स्थिति सुनिश्चित करता है। सबसे पहले, हम प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के लिए एक अंशांकन दिशानिर्देश प्रदान करते हैं । दूसरे, हम कई भ्रूण है कि नमूना रोटेशन के साथ संगत है के लिए एक बढ़ते विधि का प्रस्ताव है । तीसरे, हम ड्रोसोफिलाके अनुकरणीय त्रि-आयामी लाइव इमेजिंग डेटासेट प्रदान करते हैं, जिसके लिए हम फ्लोरोसेंटली लेबल नाभिक के साथ-साथ ट्राइबोलियमके साथ तीन ट्रांसजेनिक लाइनों को मुक़ाबला करते हैं, जिसके लिए हम तीन ट्रांसजेनिक सबलाइन के प्रदर्शन की तुलना करते हैं जो एक ही ट्रांसजीन ले जाते हैं, लेकिन विभिन्न जीनोमिक स्थानों पर। हमारा प्रोटोकॉल विशेष रूप से तुलनात्मक अध्ययनों के लिए डिज़ाइन किया गया है क्योंकि यह सक्रिय रूप से परिवेश विचरण को संबोधित करता है, जो हमेशा अनुक्रमिक लाइव इमेजिंग में मौजूद होता है। यह मात्रात्मक विश्लेषण और विबरनल फेनोटाइप के लक्षण वर्णन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जिसका परिणाम नॉकआउट प्रयोगों से होता है। इसके अलावा, यह समग्र थ्रूपुट को बढ़ाता है, जो प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप तक पहुंच सीमित होने पर अत्यधिक सुविधाजनक है। अंत में, प्रस्तावित बढ़ते विधि को अन्य कीट प्रजातियों और आगे के मॉडल जीवों, उदाहरण के लिए, ज़ेब्राफ़िश के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, मूल रूप से कोई अनुकूलन प्रयास नहीं है।
Introduction
फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी जीवन विज्ञान में सबसे आवश्यक इमेजिंग तकनीकों में से एक है, विशेष रूप से सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान में। कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप 1 में, जो199 0 के दशक के मध्य से त्रि-आयामी फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए अत्याधुनिक हैं, एक ही लेंस का उपयोग फ्लोरोफोर एक्सटिटेशन और उत्सर्जन प्रकाश का पता लगाने के लिए किया जाता है। रोशनी लेजर बीम रोशनी के साथ सभी फ्लोरोफोरस उत्तेजित/पता लगाने धुरी और संबंधित बाहर का ध्यान केंद्रित संकेत एक पिनहोल द्वारा पता लगाने से पहले भेदभाव किया जाता है । इसलिए, प्रत्येक दो आयामी छवि के लिए, पूरा नमूना प्रकाशित किया जाता है। नतीजतन, प्रत्येक त्रि-आयामी छवि के लिए, यानी, स्थानिक रूप से लगातार दो-आयामी छवियों का ढेर, पूरे नमूने को कई दर्जन से कुछ सौ गुना2तक प्रकाशित किया जाता है, जो फोटोब्लैचिंग और फोटोटोक्सीसिटी3को बढ़ावा देता है।
लगभग बीस साल पहले, प्रकाश शीट आधारित प्रौद्योगिकी4 त्रि-आयामी फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए एक आशाजनक विकल्प के रूप में उभरी और इस प्रकार विकासात्मक जीव विज्ञान5में एक मूल्यवान उपकरण बन गई। इस दृष्टिकोण में, रोशनी और पता लगाने को अलग किया जाता है। रोशनी लेंस का उपयोग लंबवत रूप से व्यवस्थित डिटेक्शन लेंस के फोकल प्लेन के भीतर केवल कुछ माइक्रोमीटर की गहराई के साथ एक प्रकाश शीट उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। इसलिए, प्रत्येक द्वि-आयामी छवि के लिए, फोकल प्लेन के चारों ओर केवल एक पतली प्लैनर मात्रा प्रकाशित की जाती है। नतीजतन, प्रत्येक त्रि-आयामी छवि के लिए, पूरा नमूना केवल एक बार प्रकाशित होता है, जो फोटोब्लैचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी6को दृढ़ता से कम करता है। इस कारण से, प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (एलएसएफएम) कई जैविक रूप से प्रासंगिक पैमानों पर जटिल प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कुशल समाधान प्रदान करते हैं और इसलिए, विकासात्मक जीव विज्ञान में विशेष मूल्य के हैं, जहां नमूनों के रूप में कई मिलीमीटर के रूप में बड़े नमूनों को उपकोशिकीय स्तर पर विश्लेषण किया जाना है।
ऐतिहासिक रूप से, एलएसएफएम का नमूना कक्ष-आधारित7,8दिया गया है। इन सेटअप में, रोशनी (एक्स) और डिटेक्शन (जेड) कुल्हाड़ियों को आमतौर पर गुरुत्वाकर्षण धुरी (वाई) के लंबवत रूप से व्यवस्थित किया जाता है। नमूना कक्ष पर्याप्त प्रयोगात्मक स्वतंत्रता प्रदान करते हैं। सबसे पहले, वे बड़ी इमेजिंग बफर क्षमताएं प्रदान करते हैं, जो बदले में पर्यावरण को नियंत्रित करने के लिए एक परफ्यूजन प्रणाली के उपयोग को आसान बनाता है, उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट तापमान9 को बनाए रखने या जैव रासायनिक तनाव लागू करने के लिए। इसके अलावा, वे अनुकूलित बढ़ते तरीकों का समर्थन करते हैं10 जो तीन आयामी को संरक्षित करते हुए संबंधित प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुरूप हैं, कुछ उदाहरणों में गतिशील11,नमूने की अखंडता। इसके अतिरिक्त, नमूना कक्ष आधारित सेटअप आमतौर पर एक रोटेशन फ़ंक्शन से लैस होते हैं जिसका उपयोग वाई अक्ष के चारों ओर नमूनों को घूमना और इस प्रकार उन्हें दो, चार या अधिक दिशाओं के साथ छवि प्रदान करता है। चूंकि आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले मॉडल जीवों के भ्रूण, माइक्रोस्कोपी के संदर्भ में, अपेक्षाकृत बड़े, वेंट्रल-पृष्ठीय, पार्श्व, और/या पूर्वकाल-पीछे शरीर कुल्हाड़ियों के साथ लगातार इमेजिंग एक अधिक व्यापक प्रतिनिधित्व प्रदान करता है । यह उन कोशिकाओं की दीर्घकालिक ट्रैकिंग की अनुमति देता है जो जटिल त्रि-आयामी प्रवास पथ12,13के साथ चलते हैं।
ड्रोसोफिला मेलनोगास्टरके भ्रूणरूपोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए प्रकाश शीट आधारित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को बड़े पैमाने पर लागू किया गया है, दोनों व्यवस्थित रूप से14,15 के साथ-साथ विकास के जैव भौतिक पहलुओं पर एक विशिष्ट ध्यान केंद्रित करते हैं। उदाहरण के लिए, इसका उपयोग उच्च-रिज़ॉल्यूशन मॉर्फोजेनेटिक डेटा इकट्ठा करने के लिए किया गया था ताकि जर्मबैंड विस्तार16 के दौरान एंडोडर्म इनवेजिनेशन और एक्सिस एक्सटेंशन के बीच बायोमैकेनिकल लिंक का पता लगाया जा सके और आगे गैस्ट्रुलेशन17के दौरान बल उत्पादन पैटर्न के साथ जटिल सेलुलर प्रवाह को संबंधित किया जा सके। इसे एपिडर्मिस18में पूर्वकाल-पीछे पैटर्निंग के दौरान डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग के नियमन की जांच करने के लिए अन्य अत्याधुनिक तकनीकों, उदाहरण के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ भी जोड़ा गया है।
हालांकि, केवल एक प्रजाति का अध्ययन विकास के विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करता है। भ्रूणजनेसिस को फिलोजेनेटिक संदर्भ के भीतर समझने के लिए वैकल्पिक कीट मॉडल जीवों के साथ गहन शोध किया गया है । सबसे व्यापक रूप से जांच की गई प्रजातियों में से एक लाल आटा बीटल ट्राइबोलियम कास्टेनियमहै , जो आर्थिक रूप से प्रासंगिक संग्रहित अनाज कीट19है , जिसका भ्रूणीय मॉर्फोजेनेसिस भी पहले से ही एलएसएफएम20के साथ व्यवस्थित रूप से चित्रित किया गया है। इन दोनों प्रजातियों के भ्रूणरूपाय कई पहलुओं में उल्लेखनीय रूप से भिन्न हैं, उदाहरण के लिए, विभाजन मोड21,साथ ही अतिरिक्त भ्रूणीय झिल्ली22का गठन और क्षरण। बाद के पहलू पहले से ही बड़े पैमाने पर LSFMs का उपयोग कर विश्लेषण किया गया है । उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि सेरोसा, एक अतिरिक्त भ्रूण ऊतक जो ट्राइबोलियम भ्रूण को अपने भ्रूण के बेहतर हिस्से के लिए विभिन्न खतरों से ढंकता है और उसकी रक्षा करताहै, 25,पृष्ठीय बंद होने केदौरानअपनी वापसी प्रक्रिया के लिए मॉर्फोजेटिक “ड्राइवर” के रूप में भी कार्य करता है। इसके अलावा, यह प्रदर्शित किया गया है कि गैस्ट्रुलेशन के दौरान, ब्लास्टोडर्म का एक विशेष क्षेत्र असममित ऊतक आंदोलनों को बनाने के लिए विटेललाइन झिल्ली में लंगर डालेरहता है और इस अवलोकन के बाद, कि क्षेत्रीयकृत ऊतक तरलीकरण कोशिकाओं को क्रमिक रूप से सेरोसा खिड़की बंद करने के दौरान सेरोसा किनारे छोड़ने की अनुमति देता है27।
सभी ड्रोसोफिलामें – और ट्राइबोलियमसे जुड़े अध्ययनों में ऊपर उद्धृत किया गया है, नमूना कक्ष-आधारित एलएसएफएम का उपयोग किया गया है। अधिकांश में, भ्रूण नमूना रोटेशन समारोह का उपयोग कर कई दिशाओं के साथ दर्ज किए गए थे । हालांकि स्पष्ट रूप से नहीं कहा गया है, यह माना जा सकता है कि उन्हें व्यक्तिगत रूप से दर्ज किया गया है और इस प्रकार अनुक्रमिक लाइव इमेजिंग परख में एक दूसरे से स्वतंत्र है, जो ट्राइबोलियम20,28पर हमारे पिछले काम के समान है। कुछ परिदृश्यों में, इस तरह के एक दृष्टिकोण स्वीकार्य है, लेकिन विशेष रूप से मात्रात्मक तुलनात्मक दृष्टिकोण में, परिवेश विचरण परिणामों को विकृत कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, यह लंबे समय से ज्ञात है कि कीड़ों की विकासात्मक गति तापमान पर निर्भर29है, लेकिन हाल के एक और अध्ययन से पता चलता है कि ड्रोसोफिलामें तापमान30मॉर्फोजन की एकाग्रता को भी प्रभावित कर सकता है। नतीजतन, यदि भ्रूणजेनेसिस की कुछ विशेषताओं, उदाहरण के लिए, गतिशील अनुपात, विभाजन दर और कोशिकाओं के प्रवास वेग, ठीक मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए, परिवेश विचरण के बिना पर्याप्त पुनरावृत्ति की आवश्यकता है । यह मानक विचलन और मानक त्रुटियों को कम करता है, जो बदले में अन्य के साथ मुक़ाबला की सुविधा देता है, यहां तक कि सिर्फ मामूली भिन्न प्रायोगिक स्थितियों को भी।
हालांकि, नमूना कक्ष आधारित LSFMs मुख्य रूप से उच्च थ्रूपुट परख के बजाय उच्च सामग्री के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के विपरीत, जो आमतौर पर माइक्रोस्कोपी स्लाइड, पेट्री व्यंजन और अच्छी प्लेटों के लिए मानकीकृत क्लैंप तंत्र से लैस होते हैं, लगभग सभी नमूना कक्ष-आधारित एलएसएफएम सिलेंडर आधारित क्लैंप तंत्र का उपयोग करते हैं। ये तंत्र कस्टम-निर्मित नमूना धारकों के लिए हैं जो रोटेशन-संगत के साथ-साथ गैर-आक्रामक10हैं, लेकिन आमतौरपर एक से अधिक नमूना20,31,32के लिए डिज़ाइन नहीं किए गए हैं। दो या अधिक भ्रूणों की एक साथ लाइव इमेजिंग के लिए एक ढांचा, जिसमें नमूना कक्ष-आधारित सेटअप के फायदों से समझौता नहीं किया जाता है, परिवेश विचरण के मुद्दे को संबोधित करता है जिससे तुलनात्मक अध्ययन के लिए एलएसएफएम का मूल्य बढ़ जाता है।
हमारे प्रोटोकॉल में, हम नमूना कक्ष आधारित LSFMs(चित्रा 1A)में तुलनात्मक लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रयोगात्मक ढांचा पेश करते हैं जिसमें वाई अक्ष का उपयोग भ्रूण को “स्टैक” करने के विकल्प के रूप में किया जाता है। सबसे पहले, हम नमूना कक्ष आधारित LSFMs के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर आधारित अंशांकन दिशानिर्देश प्रदान करते हैं, जो उन उपकरणों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जिनमें अंशांकन सहायक की कमी है। दूसरे, हम जाबवे धारक28 (चित्रा 1B)के आधार पर कई भ्रूणों के लिए एक बढ़ते विधि का वर्णन करते हैं जो नमूना रोटेशन के साथ संगत है और इस प्रकार कई दिशाओं(चित्रा 1C)के साथ कई नमूनों की एक साथ इमेजिंग की अनुमति देता है। कई भ्रूण एक पतली agarose फिल्म के शीर्ष पर गठबंधन कर रहे है और, नमूना कक्ष में प्रविष्टि के बाद, प्रकाश शीट के माध्यम से लगातार चले गए तीन आयामी छवियों को प्राप्त करने के लिए । तीसरा, हम ड्रोसोफिला के साथ-साथ ट्राइबोलियमके लिए तीन अनुकरणीय लाइव इमेजिंग डेटासेट प्रदान करते हैं। पूर्व के लिए, हम फ्लोरोसेंटली लेबल नाभिक के साथ ट्रांसजेनिक लाइनों मुक़ाबला । उत्तरार्द्ध के लिए, हम ट्रांसजेनिक सबलाइन के प्रदर्शन की तुलना करते हैं जो एक ही ट्रांसजीन ले जाते हैं, लेकिन विभिन्न जीनोमिक स्थानों पर। अंत में, हम तुलनात्मक लाइव इमेजिंग और परिवेश विचरण33के संबंध में समानांतर के महत्व पर चर्चा करते हैं, हमारे प्रयोगात्मक ढांचे की थ्रूपुट सीमा पर बहस करते हैं और अन्य मॉडल जीवों के प्रति हमारे दृष्टिकोण के अनुकूलन का मूल्यांकन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एलएसएफएम के विशेष अनुप्रयोग क्षेत्रों में से एक विकासात्मक जीव विज्ञान है। इस विधा में जीवित नमूनों को देखना महत्वपूर्ण है, अन्यथा मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रियाओं को गतिशील तरीके से वर्णित नहीं किया जा स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अर्नेस्ट एच के स्टेल्जर को अपने संसाधनों के साथ-साथ पांडुलिपि के बारे में उनकी मूल्यवान टिप्पणियों का उपयोग करने के अवसर के लिए धन्यवाद देते हैं, ट्राइबोलियम लाइव इमेजिंग के साथ समर्थन के लिए अनीता एंडरल, तकनीकी सहायता के लिए स्वेन प्लाथ के साथ-साथ इलन डेविस, निकोल ग्रिडर और गेरोल्ड शुबिगर ब्लूमिंगटन स्टॉक सेंटर के माध्यम से अपने ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लाइनों को साझा करने के लिए।
Materials
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100-µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | Only for live imaging involving Tribolium |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
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