Samtidig liveavbildning av flera insektsembryon i provkammarebaserade fluorescensmikroskop
Summary
Ljusplåtsbaserad fluorescensmikroskopi är det mest värdefulla verktyget inom utvecklingsbiologi. En viktig fråga i jämförande studier är omgivande varians. Vårt protokoll beskriver ett experimentellt ramverk för samtidig live imaging av flera exemplar och därför tar itu med denna fråga proaktivt.
Abstract
Ljusplåtsbaserad fluorescensmikroskopi erbjuder effektiva lösningar för att studera komplexa processer på flera biologiskt relevanta skalor. Provkammarebaserade inställningar, som är särskilt utformade för att bevara provexemplarets tredimensionella integritet och vanligtvis har provrotation, är det bästa valet inom utvecklingsbiologi. Till exempel har de använts för att dokumentera hela embryonala morfogar i fruktflugan Drosophila melanogaster och den röda mjölbaggen Tribolium castaneum. Många tillgängliga live imaging protokoll ger dock endast experimentella ramar för enskilda embryon. Särskilt för jämförande studier är sådana tillvägagångssätt obekväma, eftersom sekventiellt avbildade exemplar påverkas av omgivande varians. Dessutom begränsar detta antalet exemplar som kan analyseras inom en viss tid. Vi tillhandahåller ett experimentellt ramverk för samtidig live-avbildning som ökar genomströmningen i provkammarebaserade inställningar och därmed säkerställer liknande omgivningsförhållanden för alla exemplar. För det första tillhandahåller vi en kalibreringsriktlinje för fluorescensmikroskop med ljusplåt. För det andra föreslår vi en monteringsmetod för flera embryon som är förenliga med provrotation. För det tredje tillhandahåller vi exemplariska tredimensionella live imaging datasets av Drosophila, för vilka vi jämför tre transgena linjer med fluorescerande märkta atomkärnor, liksom av Tribolium, för vilka vi jämför prestandan hos tre transgena sublines som bär samma transgen, men på olika genomiska platser. Vårt protokoll är speciellt utformat för jämförande studier eftersom det proaktivt behandlar omgivande varians, som alltid finns i sekventiell live-avbildning. Detta är särskilt viktigt för kvantitativa analyser och karakterisering av avvikande fenotyper, vilket resulterar t.ex. från knockoutexperiment. Dessutom ökar det den totala genomströmningen, vilket är mycket bekvämt när tillgången till fluorescensmikroskop är begränsad. Slutligen kan den föreslagna monteringsmetoden anpassas för andra insektsarter och ytterligare modellorganismer, t.ex. zebrafisk, utan i princip ingen optimeringsinsats.
Introduction
Fluorescensmikroskopi är en av de viktigaste bildteknikerna inom biovetenskapen, särskilt inom cell- och utvecklingsbiologi. I konfikala fluorescensmikroskop1, som är toppmoderna för tredimensionell fluorescensavbildning sedan mitten av 1990-talet, används samma lins för fluorforexcitation och detektering av emissionsljus. Belysningslaserstrålen exciterar alla fluorforer längs belysnings-/detekteringsaxeln och respektive signal utanför fokus diskrimineras innan den detekterats av ett pinhole. Därför, för varje tvådimensionell bild, är hela provet upplyst. Följaktligen, för varje tredimensionell bild, dvs. en bunt rumsligt på varandra följande tvådimensionella bilder, lyser hela provet flera dussin till några hundra gånger2, vilket främjar fotoblekning och fototoxicitet3.
För nästan tjugo år sedan framträdde ljusplåtsbaseradteknik 4 som ett lovande alternativ för tredimensionell fluorescensavbildning och blev därmed ett värdefullt verktyg inom utvecklingsbiologi5. I den här metoden frikopps belysning och detektering. Belysningslinsen används för att generera ett ljust ark med ett djup på endast ett fåtal mikrometer i det vinkelrätt arrangerade detektionsobjektivets brännplan. Därför, för varje tvådimensionell bild, är endast en tunn planvolym runt brännplanet upplyst. Följaktligen, för varje tredimensionell bild, är hela provet upplyst endast en gång, vilket starkt minskar fotobleaching och fototoxicitet6. Av denna anledning erbjuder fluorescensmikroskop (LSFMs) effektiva lösningar för att studera komplexa processer på flera biologiskt relevanta skalor och är därför av särskilt värde i utvecklingsbiologi, där exemplar så stora som flera millimeter måste analyseras på subcellulär nivå.
Historiskt sett har LSFMs varit provkammarbaserade7,8. I dessa inställningar är belysningsaxlarna (x) och detekteringsaxlarna (z) vanligtvis vinkelrätt placerade mot gravitationsaxeln (y). Provkammare erbjuder gott om experimentell frihet. För det första tillhandahåller de stor kapacitet för bildbuffertar, vilket i sin tur underlättar användningen av ett perfusionssystem för att kontrollera miljön, t.ex. Vidare stöder de anpassade monteringsmetoder10 som är skräddarsydda för respektive experimentella behov samtidigt som de bevarar provexemplarets tredimensionella, i vissa falldynamiska 11,integritet. Dessutom är provkammarbaserade inställningar vanligtvis utrustade med en rotationsfunktion som används för att rotera proverna runt y-axeln och därmed avbilda dem längs två, fyra eller ännu fler riktningar. Eftersom embryon av vanliga modellorganismer i samband med mikroskopi är relativt stora, på varandra följande avbildning längs ventral-dorsala, laterala och/eller främre-bakre kroppsaxlar ger en mer omfattande representation. Detta möjliggör t.ex. långsiktig spårning av celler som rör sig längs komplexa tredimensionella migreringsbanor12,13.
Ljusplåtsbaserad fluorescensmikroskopi har tillämpats i stor utsträckning för att studera den embryonala morfogenesen hos Drosophila melanogaster,både systematiskt 14,15 samt med ett specifikt fokus på de biofysiska aspekterna av utveckling. Till exempel användes den för att samla in högupplösta morfogenetiska data för att upptäcka en biomekanisk länk mellan endoderm invagination och axelförlängning under bakteriebandsförlängning16 och vidare för att relatera det komplexa cellulära flödet med kraftgenereringsmönster under gastrulation17. Det har också kombinerats med andra toppmoderna tekniker, t.ex. optogenetik för att undersöka regleringen av Wnt-signalering under främre bakre mönstring i epidermis18.
Att studera endast en art ger dock inte insikter om utvecklingen av utvecklingen. För att förstå embryogenes i det fylogenetiska sammanhanget har intensiv forskning bedrivits med alternativa insektsmodellorganismer. En av de mest omfattande undersökta arterna är den röda mjölbaggen Tribolium castaneum, ett ekonomiskt relevant lagrat spannmålsskadedjur19, vars embryonala morfogenes också redan systematiskt har avbildats med LSFM20. Den embryonala morfogenesen hos dessa två arter skiljer sig anmärkningsvärt i flera aspekter, t.ex. segmenteringsläget21, liksom bildandet och nedbrytningen av extra embryonala membran22. Den senare aspekten har redan analyserats i stor utsträckning med LSFMs. Till exempel har det visat sig att serosa, en utom embryonal vävnad som omsluter och skyddar triboliumembryon från olika faror för större delen av embryogenesen23,24, också fungerar som den morfogenetiska “föraren” för sin egen tillbakadragandeprocess under dorsal stängning25. Vidare har det visat sig att under gastrulation förblir en viss region av blastoderm förankrad i vitelline membranet för att skapa asymmetriskavävnadsrörelser 26 och, efter denna observation, att regionaliserad vävnad fluidisering tillåter celler att sekventiellt lämna serosa kanten under serosa fönsterstängning 27.
I alla Drosophila– och Tribolium-associeradestudier som nämns ovan, provkammare-baserade LSFMs har använts. I de flesta fall registrerades embryona längs flera håll med hjälp av provrotationsfunktionen. Även om det inte uttryckligen anges, Kan det antas att de har registrerats individuellt och därmed oberoende av varandra i sekventiella levande bildanalyser, liknande vårt tidigare arbete med Tribolium20,28. I vissa scenarier är ett sådant tillvägagångssätt godtagbart, men särskilt i kvantitativa jämförande metoder kan omgivningsavvikelsen snedvrida resultaten. Till exempel har det länge varit känt att insekternas utvecklingshastighet är temperaturberoende29, men en nyare studie tyder vidare på att temperaturen i Drosophilaockså kan påverka koncentrationen av morfogener30. Om vissa egenskaper hos embryogenes, t.ex. Detta minimerar standardavvikelser och standardfel, vilket i sin tur underlättar juxtaposition med andra, till och med bara marginellt divergerande experimentella tillstånd.
Exempel på kammarbaserade LSFMs är dock främst utformade för högt innehåll snarare än höga data flödes analyser. Till skillnad från konfokala mikroskop, som vanligtvis är utrustade med standardiserade klämmekanismer för mikroskopirutschbanor, petriskålar och brunnsplattor, använder nästan alla provkammarebaserade LSFM:er cylinderbaserade klämmekanismer. Dessa mekanismer är avsedda för skräddarsydda provhållare som är rotationskompatibla samt icke-invasiva10, men vanligtvis inte utformade för mer än ett prov20,31,32. En ram för samtidig live-avbildning av två eller flera embryon, där fördelarna med provkammarbaserade inställningar inte äventyras, tar itu med problemet med omgivande varians och därigenom ökar värdet av LSFM för jämförande studier.
I vårt protokoll presenterar vi ett experimentellt ramverk för jämförande live imaging i provkammare-baserade LSFMs (Figur 1A) där y axeln används som ett alternativ att “stapla” embryon. För det första tillhandahåller vi en fluorescerande mikrosfärbaserad kalibreringsriktlinje för provkammarbaserade LSFMs, vilket är särskilt viktigt för instrument som saknar kalibreringsassistent. För det andra beskriver vi en monteringsmetod för flera embryon baserat på spindelvävshållaren28 (figur 1B) som är kompatibel med provrotation och därmed möjliggör samtidig avbildning av flera exemplar längs flera riktningar (figur 1C). Flera embryon är inriktade ovanpå en tunn agarosafilm och, efter införing i provkammaren, rör sig successivt genom ljusbladet för att förvärva tredimensionella bilder. För det tredje tillhandahåller vi tre exemplariska live imaging data uppsättningar för Drosophila samt för Tribolium. För den förstnämnda sammanar vi transgena linjer med fluorescerande märkta atomkärnor. För den senare jämför vi prestandan hos transgena sublines som bär samma transgen, men på olika genomiska platser. Slutligen diskuterar vi vikten av parallellisering när det gäller jämförande levande avbildning och omgivande varians33, diskuterar genomströmningsgränsen för vårt experimentella ramverk och utvärderar anpassningen av vårt förhållningssätt till andra modellorganismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett av de exklusiva tillämpningsområdena för LSFMs är utvecklingsbiologi. I denna disciplin är det viktigt att titta på levande exemplar, annars kan morfogenetiska processer inte beskrivas på ett dynamiskt sätt. Ett experimentellt ramverk för samtidig live imaging i provkammare-baserade LSFMs, som beskrivs här, är bekvämt av två huvudskäl.
Omgivande varians, som är oundviklig i sekventiell live imaging, kan hanteras proaktivt. Vid insektsembryon-associerad levande avbildning ser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Ernst H. K. Stelzer för möjligheten att använda sina resurser samt hans värdefulla kommentarer om manuskriptet, Anita Anderl för stöd med Tribolium live imaging, Sven Plath för teknisk support samt Ilan Davis, Nicole Grieder och Gerold Schubiger för att dela sina transgena Drosophila-linjer via Bloomington Stock Center.
Materials
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100-µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | Only for live imaging involving Tribolium |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
References
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
- Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
- Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
- Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
- El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
- Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
- Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
- Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
- Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
- Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
- Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
- Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
- Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
- Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
- Mcdonald, J. H. . Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , (2013).
- Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
- Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
- Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
- Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
- He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
- Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
- Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , (1997).
- Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
- McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
- Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
- Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
- Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
- Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).
