Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas
Summary
Este protocolo proporciona herramientas experimentales in vitro para evaluar la transformación de las células mamarias humanas. Se describen los pasos detallados para el seguimiento de la tasa de proliferación celular, la capacidad de crecimiento independiente del anclaje y la distribución de linajes celulares en cultivos 3D con matriz de membrana de sótano.
Abstract
La tumorigenesis es un proceso de varios pasos en el que las células adquieren capacidades que permiten su crecimiento, supervivencia y diseminación en condiciones hostiles. Diferentes pruebas buscan identificar y cuantificar estas señas de identidad de las células cancerosas; sin embargo, a menudo se centran en un solo aspecto de la transformación celular y, de hecho, se requieren múltiples pruebas para su caracterización adecuada. El propósito de este trabajo es proporcionar a los investigadores un conjunto de herramientas para evaluar la transformación celular in vitro desde una perspectiva amplia, lo que permite sacar conclusiones sólidas.
Una activación de señalización proliferativa sostenida es la característica principal de los tejidos tumorales y puede ser fácilmente monitoreada en condiciones in vitro calculando el número de duplicaciones de población logradas con el tiempo. Además, el crecimiento de las células en cultivos 3D permite su interacción con las células circundantes, que se asemeja a lo que ocurre in vivo. Esto permite la evaluación de la agregación celular y, junto con el etiquetado inmunofluorescente de marcadores celulares distintivos, obtener información sobre otra característica relevante de la transformación tumoral: la pérdida de una organización adecuada. Otra característica notable de las células transformadas es su capacidad para crecer sin un apego a otras células y a la matriz extracelular, que se puede evaluar con el ensayo de anclaje.
Se proporcionan procedimientos experimentales detallados para evaluar la tasa de crecimiento celular, realizar el etiquetado inmunofluorescente de marcadores de linaje celular en cultivos 3D y para probar el crecimiento celular independiente del anclaje en el agar blando. Estas metodologías están optimizadas para las células epiteliales primarias de mama (BPEC) debido a su relevancia en el cáncer de mama; sin embargo, los procedimientos se pueden aplicar a otros tipos de celda después de algunos ajustes.
Introduction
Se requieren varios eventos sucesivos para el desarrollo de neoplasias. En 2011, Hanahan y Weinberg describieron 10 capacidades que permiten transformar el crecimiento, la supervivencia y la difusión de las células: las llamadas “Marcas del Cáncer”1. La metodología descrita aquí compila tres herramientas diferentes para evaluar la transformación celular in vitro centrándose en algunas de las características distintivas de las células tumorales. Estas técnicas evalúan la tasa de proliferación celular, el comportamiento de las células cuando se cultivan en 3D y su capacidad para formar colonias con independencia de anclaje.
Los modelos celulares son cruciales para probar la hipótesis in vitro. Se han desarrollado diferentes enfoques para generar modelos experimentales de transformación celular para el estudio del cáncer2,3,4. Dado que el cáncer de mama es el cáncer más común entre las mujeres en todo el mundo y es responsable de aproximadamente el 15% de las muertes por cáncer entre las mujeres5,proporcionar modelos celulares adecuados de células epiteliales mamarias es de suma importancia para la investigación posterior. En este artículo, hemos ilustrado el potencial de tres técnicas para evaluar la transformación celular utilizando un modelo experimental de transformación de células epiteliales primarias de senos (BPEC) descrita inicialmente por Ince y sus colegas en 20076 y posteriormente implementada en nuestro laboratorio7. Este modelo experimental se basa en la alteración secuencial de tres genes dirigidos (SV40 Grandes T y antígenos t pequeños aquí conocidos como Ttag, hTERTy HRAS)al genoma de BPEC no transformados. Además, el método utilizado para la derivación de BPEC favorece el mantenimiento de células epiteliales mamarias con marcadores luminales o mioepteliales, dando como resultado un cultivo celular heterogéneo que conserva algunos de los rasgos fisiológicos de la glándula mamaria.
En la glándula mamaria, las células epiteliales mamarias luminales, que son responsables de la producción de leche, se encuentran cerca del lumen, mientras que las células mioepteliales se eliminan alrededor de las células luminales y se encargan de los movimientos de contracción que conducen la leche al pezón. La pérdida de una organización adecuada entre estos linajes celulares es una característica de la transformación tumoral8 que se puede evaluar in vitro después de la detección inmunofluorescente de marcadores de linaje distintivos en cultivos celulares 3D. Otra característica importante de las células tumorales es su capacidad para crecer sin un apego a otras células y a la matriz extracelular1. Cuando las células sanas se ven obligadas a crecer en suspensión, se activan mecanismos como los anoikis u2012 un tipo de muerte celular inducida en respuesta al desprendimiento de la matriz extracelular de la matriz extracelular9. La evasión de la muerte celular es una de las señas de identidad distintivas del cáncer y, por lo tanto, las células transformadas son capaces de inactivar los anoikis y sobrevivir de una manera independiente del ancla. Esta capacidad se puede evaluar in vitro con el ensayo independiente del anclaje utilizando agar blando. Además, una característica inherente de los tejidos tumorales es su capacidad de señalización proliferativa sostenida, que puede controlarse fácilmente en condiciones in vitro midiendo el aumento del número de células a lo largo del tiempo, no sólo en los ensayos de suspensión, sino también mediante el seguimiento de la tasa de crecimiento de los cultivos monocapa adherentes.
A pesar del mejor modelo para probar el potencial tumorigénico es la inoculación de células tumorales en modelos murinos y la evaluación del desarrollo tumoral in situ, es importante minimizar el número de animales empleados en procedimientos experimentales tanto como sea posible. Por lo tanto, tener pruebas adecuadas para evaluar la transformación in vitro es una prioridad. Aquí, proporcionamos un conjunto de herramientas para evaluar el potencial tumorigénico de las células epiteliales mamarias parcialmente y totalmente transformadas que se pueden implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios que trabajan con modelos de transformación celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos experimentales descritos en este documento proporcionan herramientas útiles para evaluar la transformación oncogénica de las células cultivadas in vitro. Cada técnica evalúa aspectos específicos del proceso de transformación y, por lo tanto, se debe prestar especial atención al extraer conclusiones de un solo análisis. La acumulación de curvas de crecimiento es un enfoque que exige información ya disponible al cultivar células para otros fines. Esto hace que esta técnica sea más barata y fá…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El laboratorio AG está financiado por el Consejo Español de Seguridad Nuclear. T.A. y A.G. son miembros de un grupo de investigación reconocido por la Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT tiene un contrato financiado por la Fundación Científica Asociación Española Contra el Cáncer. El contrato de G.F. es financiado por una subvención de cellex Foundation.
Materials
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage |
| 10 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glass bottle | With cap, autoclavable | ||
| 1000 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conical tubes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conical Tubes | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Used for anchorage assay |
| Anti-Claudin 4 antibody | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cell culture 24-well Plate | Labclinics | PLC30024 | Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom |
| Cell culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | Used for anchorage assay |
| Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2) | |||
| Cell Strainers | Fisherbrand | 11587522 | Mesh size: 40 μm |
| CellSense software | Olympus | Used to image acquisition | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Used to supplement cell culture medium |
| Class II Biological Safety Cabinet | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocal inverted Microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cover glasses | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, thickness 0.13 – 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | Used to inactivate trypsine action |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Free download, no license needed |
| Glass Pasteur Pipettes | |||
| Glass slides | Fisherbrand | 11844782 | |
| Goat Serum | Biowest | S2000 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Heat-Resistant Gloves | Used for agar manipulation after autoclave | ||
| Heater bath (37 ºC) | Used to temper solutions prior to cell subculture | ||
| Heater bath (42 ºC) | Used to keep agar warm | ||
| Heating plate | Used for Matrigel dehydration | ||
| Humid chamber | Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence | ||
| Ice | Used during Matrigel manipulation | ||
| Ice-box | |||
| Inverted Optic Microscope | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Micropipette | p1000, p200 and p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation |
| MilliQ water | Referred to as ultrapure water | ||
| Nail Polish | Used to seal samples after mounting | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Used to cover antibody solution during incubation |
| PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Used for cell subculture |
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 flasks | Corning | 353808 | Used for BPEC culture |
| Scepter Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20060 | Alternatively, use an haemocytometer |
| Scissors | Used to cut pipette tips and parafilm | ||
| Sterile filters 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | Used to filter MTT solution |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Store at -20 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Dilute in PBS to obtain 3X solution |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Used for primary BPEC culture |
| WIT-T Culture Medium | Stemgent | 00-0047 | Used for transformed BPEC culture |
References
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