Évaluation in vitro de la transformation oncogène des cellules épithéliales mammaires humaines
Summary
Ce protocole fournit des outils expérimentaux in vitro pour évaluer la transformation des cellules mammaires humaines. Des étapes détaillées pour le taux de prolifération cellulaire de suivi, la capacité de croissance ancre-indépendante, et la distribution des lignées cellulaires dans les cultures 3D avec la matrice de membrane de sous-sol sont décrites.
Abstract
Tumorigenesis est un processus en plusieurs étapes dans lequel les cellules acquièrent des capacités qui permettent leur croissance, survie et diffusion dans des conditions hostiles. Différents tests visent à identifier et quantifier ces caractéristiques des cellules cancéreuses; cependant, ils se concentrent souvent sur un seul aspect de la transformation cellulaire et, en fait, plusieurs tests sont nécessaires pour leur caractérisation appropriée. Le but de ces travaux est de fournir aux chercheurs un ensemble d’outils pour évaluer la transformation cellulaire in vitro d’un point de vue large, permettant ainsi de tirer des conclusions solides.
Une activation proliférative soutenue de signalisation est la principale caractéristique des tissus tumoraux et peut être facilement surveillée dans des conditions in vitro en calculant le nombre de doublons de population réalisés au fil du temps. En outre, la croissance des cellules dans les cultures 3D permet leur interaction avec les cellules environnantes, ressemblant à ce qui se passe in vivo. Ceci permet l’évaluation de l’agrégation cellulaire et, avec l’étiquetage immunofluorescent des marqueurs cellulaires distinctifs, d’obtenir l’information sur une autre caractéristique pertinente de la transformation tumorale : la perte de l’organisation appropriée. Une autre caractéristique remarquable des cellules transformées est leur capacité à croître sans attachement à d’autres cellules et à la matrice extracellulaire, qui peut être évaluée avec l’analyse d’ancrage.
Des procédures expérimentales détaillées pour évaluer le taux de croissance cellulaire, pour effectuer l’étiquetage immunofluorescent des marqueurs de lignée cellulaire dans les cultures 3D, et pour tester la croissance cellulaire indépendante de l’ancrage chez les agars mous sont fournies. Ces méthodologies sont optimisées pour les cellules épithéliales primaires du sein (BPEC) en raison de sa pertinence dans le cancer du sein; cependant, les procédures peuvent être appliquées à d’autres types de cellules après quelques ajustements.
Introduction
Plusieurs événements successifs sont nécessaires pour le développement du néoplasme. En 2011, Hanahan et Weinberg ont décrit 10 capacités qui permettent la croissance, la survie et la diffusion des cellules transformées : les « caractéristiques du cancer» 1. La méthodologie décrite ici compile trois outils différents pour évaluer la transformation cellulaire in vitro en se concentrant sur certaines des caractéristiques distinctives des cellules tumorales. Ces techniques évaluent le taux de prolifération cellulaire, le comportement des cellules lorsqu’elles sont cultivés en 3D et leur capacité à former des colonies avec l’indépendance de l’ancrage.
Les modèles cellulaires sont essentiels pour tester l’hypothèse in vitro. Différentes approches ont été développées pour générer des modèles expérimentaux de transformation cellulaire pour l’étude du cancer2,3,4. Étant donné que le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez les femmes dans le monde et est responsable d’environ 15% des décès par cancer chezles femmes 5, fournir des modèles cellulaires appropriés de cellules épithéliales mammaires est de la plus haute importance pour une enquête plus approfondie. Dans cet article, nous avons illustré le potentiel de trois techniques pour évaluer la transformation cellulaire à l’aide d’un modèle expérimental de transformation des cellules épithéliales primaires du sein (BPECs) initialement décrite par Ince et ses collègues en 20076 et mise en œuvre ultérieurement dans notrelaboratoire 7. Ce modèle expérimental est basé sur l’altération séquentielle de trois gènes ciblés (SV40 Gros T et petits antigènes t ci-dessous appelés Ttag, hTERTet HRAS)au génome des BPECs non transformés. En outre, la méthode utilisée pour la dérivation bpecs favorise le maintien des cellules épithéliales mammaires avec des marqueurs luminaux ou myoepithelial, résultant en une culture cellulaire hétérogène qui conserve certains des traits physiologiques de la glande mammaire.
Dans la glande mammaire, les cellules épithéliales mammaires luminaires, qui sont responsables de la production laitière, sont situées près du lumen, tandis que les cellules myoepitheliales sont éliminées autour des cellules luminaires et prennent soin des mouvements de contraction menant le lait au mamelon. La perte de l’organisation appropriée entre ces lignées cellulaires est une caractéristique de la transformation tumorale8 qui peut être évaluée in vitro après détection immunofluorescente des marqueurs distinctifs de lignée dans les cultures cellulaires 3D. Une autre caractéristique majeure des cellules tumorales est leur capacité à croître sans attachement à d’autres cellules et à la matrice extracellulaire1. Lorsque les cellules saines sont forcées de croître en suspension, des mécanismes tels que anoikis \u2012 un type de mort cellulaire induite en réponse au détachement de la matrice extracellulaire \u2012 sont activés9. L’évasion de la mort cellulaire est l’une des caractéristiques distinctives du cancer et, par conséquent, les cellules transformées sont capables d’inactiver les anoikis et de survivre d’une manière indépendante de l’ancre. Cette capacité peut être évaluée in vitro avec l’analyse indépendante de l’ancrage à l’aide d’une agar molle. En outre, une caractéristique inhérente des tissus tumoraux est leur capacité de signalisation proliférative soutenue, qui peut être facilement surveillée dans des conditions in vitro en mesurant l’augmentation du nombre de cellules le long du temps, non seulement dans les tests de suspension, mais aussi en surveillant le taux de croissance des cultures adhérentes monocouches.
En dépit du meilleur modèle pour tester le potentiel tumorigenic est l’inoculation des cellules tumorales dans les modèles murins et l’évaluation du développement de tumeur in situ, il est important de réduire au minimum le nombre d’animaux employés dans les procédures expérimentales autant que possible. Par conséquent, avoir des tests appropriés pour évaluer la transformation in vitro est une priorité absolue. Ici, nous fournissons un ensemble d’outils pour évaluer le potentiel tumoriogène des cellules épithéliales du sein partiellement et entièrement transformées qui peuvent être facilement mises en œuvre dans la plupart des laboratoires qui travaillent avec des modèles de transformation cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles expérimentaux décrits dans cet article fournissent des outils utiles pour évaluer la transformation oncogène des cellules de culture in vitro. Chaque technique évalue des aspects spécifiques du processus de transformation et, par conséquent, une attention particulière doit être accordée lors de l’élaboration de conclusions à partir d’une seule analyse. L’accumulation des courbes de croissance est une approche qui exige des informations déjà disponibles lors de la culture des cellules à…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le laboratoire AG est financé par le Conseil espagnol de sûreté nucléaire. T.A. et A.G. font partie d’un groupe de recherche reconnu par la Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT détient un contrat financé par la Fondation scientifique Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. Le contrat G.F. est financé par une subvention de la Fondation Cellex.
Materials
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage |
| 10 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glass bottle | With cap, autoclavable | ||
| 1000 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conical tubes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conical Tubes | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Used for anchorage assay |
| Anti-Claudin 4 antibody | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cell culture 24-well Plate | Labclinics | PLC30024 | Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom |
| Cell culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | Used for anchorage assay |
| Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2) | |||
| Cell Strainers | Fisherbrand | 11587522 | Mesh size: 40 μm |
| CellSense software | Olympus | Used to image acquisition | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Used to supplement cell culture medium |
| Class II Biological Safety Cabinet | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocal inverted Microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cover glasses | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, thickness 0.13 – 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | Used to inactivate trypsine action |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Free download, no license needed |
| Glass Pasteur Pipettes | |||
| Glass slides | Fisherbrand | 11844782 | |
| Goat Serum | Biowest | S2000 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Heat-Resistant Gloves | Used for agar manipulation after autoclave | ||
| Heater bath (37 ºC) | Used to temper solutions prior to cell subculture | ||
| Heater bath (42 ºC) | Used to keep agar warm | ||
| Heating plate | Used for Matrigel dehydration | ||
| Humid chamber | Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence | ||
| Ice | Used during Matrigel manipulation | ||
| Ice-box | |||
| Inverted Optic Microscope | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Micropipette | p1000, p200 and p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation |
| MilliQ water | Referred to as ultrapure water | ||
| Nail Polish | Used to seal samples after mounting | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Used to cover antibody solution during incubation |
| PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Used for cell subculture |
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 flasks | Corning | 353808 | Used for BPEC culture |
| Scepter Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20060 | Alternatively, use an haemocytometer |
| Scissors | Used to cut pipette tips and parafilm | ||
| Sterile filters 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | Used to filter MTT solution |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Store at -20 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Dilute in PBS to obtain 3X solution |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Used for primary BPEC culture |
| WIT-T Culture Medium | Stemgent | 00-0047 | Used for transformed BPEC culture |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).
- Schinzel, A. C., Hahn, W. C. Oncogenic transformation and experimental models of human cancer. Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71 (2008).
- Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nature Communications. 8 (1), 15422 (2017).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Ince, T. A., et al. Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes. Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).
- Repullés, J., et al. Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells. Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brocher, J. The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox. European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112 (2015).
- Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. Is random close packing of spheres well defined. Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis. Breast Cancer Research. 20 (1), 65 (2018).
