Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas
Summary
Este protocolo fornece ferramentas in vitro experimentais para avaliar a transformação das células mamárias humanas. São descritas etapas detalhadas para a taxa de proliferação celular de acompanhamento, capacidade de crescimento independente de ancoragem e distribuição de linhagens celulares em culturas 3D com matriz de membrana de porão.
Abstract
Tumorigênese é um processo de várias etapas no qual as células adquirem capacidades que permitem seu crescimento, sobrevivência e disseminação em condições hostis. Diferentes testes buscam identificar e quantificar essas marcas de células cancerosas; no entanto, muitas vezes eles se concentram em um único aspecto da transformação celular e, de fato, múltiplos testes são necessários para sua caracterização adequada. O objetivo deste trabalho é fornecer aos pesquisadores um conjunto de ferramentas para avaliar a transformação celular in vitro de uma perspectiva ampla, possibilitando assim tirar conclusões sonoras.
Uma ativação de sinalização proliferativa sustentada é a principal característica dos tecidos tumorais e pode ser facilmente monitorada em condições in vitro, calculando o número de duplicações populacionais alcançadas ao longo do tempo. Além disso, o crescimento de células em culturas 3D permite sua interação com células circundantes, assemelhando-se ao que ocorre in vivo. Isso permite a avaliação da agregação celular e, juntamente com a rotulagem imunofluorescente de marcadores celulares distintos, obter informações sobre outra característica relevante da transformação tumoral: a perda da organização adequada. Outra característica notável das células transformadas é sua capacidade de crescer sem apego a outras células e à matriz extracelular, que pode ser avaliada com o ensaio de ancoragem.
Procedimentos experimentais detalhados para avaliar a taxa de crescimento celular, para realizar rotulagem imunofluorescente de marcadores de linhagem celular em culturas 3D e para testar o crescimento celular independente de ancoragem em ágar macio são fornecidos. Essas metodologias são otimizadas para células epiteliais primárias de mama (BPEC) devido à sua relevância no câncer de mama; no entanto, os procedimentos podem ser aplicados a outros tipos de células após alguns ajustes.
Introduction
Múltiplos eventos sucessivos são necessários para o desenvolvimento da neoplasia. Em 2011, Hanahan e Weinberg descreveram 10 capacidades que permitem o crescimento, sobrevivência e disseminação das células transformadas: as chamadas “Marcas do Câncer”1. A metodologia descrita aqui compila três diferentes ferramentas para avaliar a transformação celular in vitro, focando em algumas das características distintas das células tumorais. Essas técnicas avaliam a taxa de proliferação celular, o comportamento das células quando cultivadas em 3D e sua capacidade de formar colônias com independência de ancoragem.
Modelos celulares são cruciais para testar hipóteses in vitro. Diferentes abordagens foram desenvolvidas para gerar modelos experimentais de transformação celular para o estudo do câncer2,3,4. Como o câncer de mama é o câncer mais comum entre as mulheres em todo o mundo e é responsável por aproximadamente 15% das mortes por câncer entre mulheres5, fornecer modelos celulares adequados de células epiteliais mamárias é de extrema importância para uma investigação mais aprofundada. Neste artigo, ilustramos o potencial de três técnicas para avaliar a transformação celular utilizando um modelo experimental de transformação de Células Epiteliais Primárias de Mama (BPECs) inicialmente descritas pelo Ince e colegas em 20076 e posteriormente implementadas em nosso laboratório7. Este modelo experimental baseia-se na alteração sequencial de três genes-alvo (SV40 Large T e pequenos antígenos t aqui referidos como Ttag, hTERT, e HRAS) ao genoma de BPECs não transformados. Além disso, o método utilizado para a derivação de BPECs favorece a manutenção de células epiteliais mamárias com marcadores luminosos ou mioepitheliais, resultando em uma cultura celular heterogênea que retém alguns dos traços fisiológicos da glândula mamária.
Na glândula mamária, as células epiteliais amamárias luminais, responsáveis pela produção do leite, estão localizadas perto do lúmen, enquanto as células mioepiteliais são dispostas ao redor de células luminais e cuidam dos movimentos de contração que levam o leite ao mamilo. A perda de organização adequada entre essas linhagens celulares é uma característica da transformação tumoral8 que pode ser avaliada in vitro após a detecção imunofluorescente de marcadores de linhagem distintivos em culturas celulares 3D. Outra característica importante das células tumorais é sua capacidade de crescer sem apego a outras células e à matriz extracelular1. Quando as células saudáveis são forçadas a crescer em suspensão, mecanismos como anoikis \u2012 um tipo de morte celular induzida em resposta ao descolamento da matriz extracelular \u2012 são ativados9. A evasão da morte celular é uma das marcas distintas do câncer e, portanto, as células transformadas são capazes de inativar anoikis e sobreviver de forma independente da âncora. Esta capacidade pode ser avaliada in vitro com o ensaio independente de ancoragem usando ágar macio. Além disso, uma característica inerente dos tecidos tumorais é sua capacidade de sinalização proliferativa sustentada, que pode ser facilmente monitorada em condições in vitro medindo o aumento do número celular ao longo do tempo, não apenas em ensaios de suspensão, mas também monitorando a taxa de crescimento das culturas aderentes de monocamadas.
Apesar do melhor modelo para testar o potencial tumorigênico é a inoculação de células tumorais em modelos murinos e a avaliação do desenvolvimento do tumor in situ, é importante minimizar o número de animais empregados em procedimentos experimentais o máximo possível. Portanto, ter testes adequados para avaliar a transformação in vitro é uma prioridade máxima. Aqui, fornecemos um conjunto de ferramentas para avaliar o potencial tumorigênico de células epiteliais mamárias parcial e totalmente transformadas que podem ser facilmente implementadas na maioria dos laboratórios que trabalham com modelos de transformação celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos experimentais descritos neste artigo fornecem ferramentas úteis para avaliar a transformação oncogênica de células cultivadas in vitro. Cada técnica avalia aspectos específicos do processo de transformação e, portanto, deve-se prestar atenção especial ao tirar conclusões de uma única análise. O acúmulo de curvas de crescimento é uma abordagem que exige informações já disponíveis ao criar células para outros fins. Isso torna essa técnica mais barata e fácil de aplicar em comparação c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O laboratório ag é financiado pelo Conselho Espanhol de Segurança Nuclear. T.A. e A.G. são membros de um grupo de pesquisa reconhecido pela Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). A MT detém um contrato financiado pela Fundação Científica Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. O contrato da G.F. é financiado por uma bolsa da Fundação Cellex.
Materials
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage |
| 10 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glass bottle | With cap, autoclavable | ||
| 1000 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conical tubes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conical Tubes | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Used for anchorage assay |
| Anti-Claudin 4 antibody | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cell culture 24-well Plate | Labclinics | PLC30024 | Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom |
| Cell culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | Used for anchorage assay |
| Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2) | |||
| Cell Strainers | Fisherbrand | 11587522 | Mesh size: 40 μm |
| CellSense software | Olympus | Used to image acquisition | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Used to supplement cell culture medium |
| Class II Biological Safety Cabinet | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocal inverted Microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cover glasses | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, thickness 0.13 – 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | Used to inactivate trypsine action |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Free download, no license needed |
| Glass Pasteur Pipettes | |||
| Glass slides | Fisherbrand | 11844782 | |
| Goat Serum | Biowest | S2000 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Heat-Resistant Gloves | Used for agar manipulation after autoclave | ||
| Heater bath (37 ºC) | Used to temper solutions prior to cell subculture | ||
| Heater bath (42 ºC) | Used to keep agar warm | ||
| Heating plate | Used for Matrigel dehydration | ||
| Humid chamber | Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence | ||
| Ice | Used during Matrigel manipulation | ||
| Ice-box | |||
| Inverted Optic Microscope | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Micropipette | p1000, p200 and p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation |
| MilliQ water | Referred to as ultrapure water | ||
| Nail Polish | Used to seal samples after mounting | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Used to cover antibody solution during incubation |
| PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Used for cell subculture |
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 flasks | Corning | 353808 | Used for BPEC culture |
| Scepter Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20060 | Alternatively, use an haemocytometer |
| Scissors | Used to cut pipette tips and parafilm | ||
| Sterile filters 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | Used to filter MTT solution |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Store at -20 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Dilute in PBS to obtain 3X solution |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Used for primary BPEC culture |
| WIT-T Culture Medium | Stemgent | 00-0047 | Used for transformed BPEC culture |
References
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