मानव स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं में ओंकोजेनिक परिवर्तन का विट्रो मूल्यांकन
Summary
यह प्रोटोकॉल मानव स्तन कोशिकाओं के परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोगात्मक इन विट्रो उपकरण प्रदान करता है। अनुवर्ती सेल प्रसार दर, एंकरेज-स्वतंत्र विकास क्षमता, और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ 3 डी संस्कृतियों में सेल वंश के वितरण के लिए विस्तृत कदम वर्णित हैं।
Abstract
ट्यूमरजीनेसिस एक बहु-चरण प्रक्रिया है जिसमें कोशिकाएं ऐसी क्षमताएं प्राप्त करती हैं जो शत्रुतापूर्ण परिस्थितियों में उनके विकास, अस्तित्व और प्रसार की अनुमति देती हैं। विभिन्न परीक्षण कैंसर कोशिकाओं की इन पहचान की पहचान और मात्रा निर्धारित करना चाहते हैं; हालांकि, वे अक्सर सेलुलर परिवर्तन के एक पहलू पर ध्यान केंद्रित करते हैं और वास्तव में, उनके उचित लक्षण वर्णन के लिए कई परीक्षणों की आवश्यकता होती है। इस काम का उद्देश्य शोधकर्ताओं को व्यापक परिप्रेक्ष्य से विट्रो में सेलुलर परिवर्तन का आकलन करने के लिए उपकरणों का एक सेट प्रदान करना है, जिससे ध्वनि निष्कर्ष निकालना संभव हो सके।
एक निरंतर प्रसार संकेत सक्रियण ट्यूमर ऊतकों की प्रमुख विशेषता है और समय के साथ प्राप्त जनसंख्या दोहरीकरण की संख्या की गणना करके इन विट्रो स्थितियों के तहत आसानी से निगरानी की जा सकती है। इसके अलावा, 3 डी संस्कृतियों में कोशिकाओं का विकास आसपास की कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत की अनुमति देता है, जो वीवो में होता है। यह सेलुलर एकत्रीकरण के मूल्यांकन में सक्षम बनाता है और, एक साथ विशिष्ट सेलुलर मार्कर की इम्यूनोफ्लोर्सेंट लेबलिंग के साथ, ट्यूमर परिवर्तन की एक और प्रासंगिक विशेषता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए: उचित संगठन का नुकसान। परिवर्तित कोशिकाओं की एक और उल्लेखनीय विशेषता अन्य कोशिकाओं के प्रति लगाव के बिना और बाह्य मैट्रिक्स के लिए विकसित करने की उनकी क्षमता है, जिसका मूल्यांकन एंकरेज परख के साथ किया जा सकता है।
सेल विकास दर का मूल्यांकन करने, 3 डी संस्कृतियों में सेल वंश मार्कर की इम्यूनोफ्लोरेटेंट लेबलिंग करने और नरम आगार में एंकोरेज-स्वतंत्र सेल वृद्धि का परीक्षण करने के लिए विस्तृत प्रायोगिक प्रक्रियाएं प्रदान की जाती हैं। स्तन कैंसर में इसकी प्रासंगिकता के कारण इन पद्धतियों को स्तन प्राथमिक एपिथेलियल कोशिकाओं (बीपीईसी) के लिए अनुकूलित किया जाता है; हालांकि, प्रक्रियाओं को कुछ समायोजन के बाद अन्य सेल प्रकारों पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
नियोप्लाज्म विकास के लिए लगातार कई घटनाओं की आवश्यकता होती है। २०११ में, हहान और वेनबर्ग ने 10 क्षमताओं का वर्णन किया जो कोशिकाओं के विकास, अस्तित्व और प्रसार को बदल देते हैं: तथाकथित “कैंसर की पहचान”1। यहां वर्णित पद्धति ट्यूमर कोशिकाओं की विशिष्ट विशेषताओं में से कुछ पर ध्यान केंद्रित करके इन विट्रो सेलुलर परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए तीन अलग-अलग उपकरण संकलित करती है। ये तकनीकें सेल प्रसार दर, कोशिकाओं के व्यवहार का आकलन करती हैं जब 3 डी में सुसंस्कृत होती हैं और एंकरेज स्वतंत्रता के साथ उपनिवेश बनाने की उनकी क्षमता होती है।
सेल मॉडल विट्रो में परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। कैंसर के अध्ययन के लिए सेलुलर परिवर्तन के प्रयोगात्मक मॉडल तैयार करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं ,3,4. चूंकि स्तन कैंसर दुनिया भर में महिलाओं के बीच सबसे आम कैंसर है और महिलाओं के बीच कैंसर से होने वाली मौतों के लगभग 15% के लिए जिम्मेदार है,5,स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं के उपयुक्त सेलुलर मॉडल प्रदान करना आगे की जांच के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। इस लेख में, हमने 20076 में Ince और सहयोगियों द्वारा वर्णित स्तन प्राथमिक एपिथेलियल कोशिकाओं (बीपीईसीएस) परिवर्तन के प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग करके सेलुलर परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए तीन तकनीकों की क्षमता को चित्रित किया है और बाद में हमारी प्रयोगशाला7में लागू किया गया। यह प्रायोगिक मॉडल तीन लक्षित जीन (एसवी 40 बड़े टी और छोटे टी एंटीजन के अनुक्रमिक परिवर्तन पर आधारित है, जिसे टीटैग, एचआरटीटीऔर एचआरएएस कहा जाताहै) गैर-परिवर्तित बीपीईसी के जीनोम के लिए। इसके अलावा, BPECs व्युत्पन्न के लिए उपयोग की जाने वाली विधि चमकदार या मायोपिथेलियल मार्कर के साथ स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं के रखरखाव के पक्ष में है, जिसके परिणामस्वरूप एक विषम कोशिका संस्कृति होती है जो कुछ स्तन ग्रंथि शारीरिक लक्षणों को बरकरार रखती है।
स्तन ग्रंथि में, ल्यूमिनल स्तन एपिथेलियल कोशिकाएं, जो दूध उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं, ल्यूमेन के पास स्थित होती हैं, जबकि मायोएपिथेलियल कोशिकाओं को ल्यूमिनल कोशिकाओं के आसपास निपटाया जाता है और दूध को निप्पल तक ले जाने वाले संकुचन आंदोलनों का ख्याल रखते हैं। इन सेल वंश के बीच उचित संगठन का नुकसान ट्यूमर परिवर्तन 8 की एक विशेषता है जिसे3 डी सेल संस्कृतियों में विशिष्ट वंश मार्कर के इम्यूनोफ्लोरोसेंट डिटेक्शन के बाद विट्रो में मूल्यांकन किया जा सकता है। ट्यूमर कोशिकाओं की एक और प्रमुख विशेषता अन्य कोशिकाओं से लगाव के बिना और बाह्राम मैट्रिक्स1के लिए विकसित करने की उनकी क्षमता है । जब स्वस्थ कोशिकाओं को निलंबन में बढ़ने के लिए मजबूर किया जाता है, तो एनोकिस \ u2012 जैसे तंत्र एक प्रकार की कोशिका मृत्यु जो एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स से टुकड़ी के जवाब में प्रेरित होती है \ u20129सक्रिय हैं। सेल डेथ की चोरी कैंसर की विशिष्ट पहचान में से एक है और इस प्रकार, परिवर्तित कोशिकाएं एनोकी को निष्क्रिय करने और एंकर-स्वतंत्र तरीके से जीवित रहने में सक्षम हैं। इस क्षमता का मूल्यांकन कोमल आगार का उपयोग करके एंकरेज-स्वतंत्र परख के साथ विट्रो में किया जा सकता है। इसके अलावा, ट्यूमर ऊतकों की एक अंतर्निहित विशेषता उनकी निरंतर प्रसारीय संकेत क्षमता है, जिसे समय के साथ सेल संख्या में वृद्धि को मापने के द्वारा इन विट्रो स्थितियों के तहत आसानी से निगरानी की जा सकती है, न केवल निलंबन परख में बल्कि मोनोलेयर अनुयायी संस्कृतियों की वृद्धि दर की निगरानी करके भी।
ट्यूमरजनित क्षमता का परीक्षण करने के लिए सबसे अच्छा मॉडल के बावजूद मुरीन मॉडल में ट्यूमर कोशिकाओं का टीका और सीटू में ट्यूमर के विकास का मूल्यांकन है, यह जितना संभव हो प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में नियोजित जानवरों की संख्या को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, विट्रो में परिवर्तन का आकलन करने के लिए उपयुक्त परीक्षण करना सर्वोच्च प्राथमिकता है। यहां, हम आंशिक रूप से और पूरी तरह से परिवर्तित स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं की ट्यूमरजनित क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उपकरणों का एक सेट प्रदान करते हैं जिन्हें सेलुलर परिवर्तन मॉडल के साथ काम करने वाली अधिकांश प्रयोगशालाओं में आसानी से लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में वर्णित प्रायोगिक प्रोटोकॉल इन विट्रो सुसंस्कृत कोशिकाओं के ऑन्कोजेनिक परिवर्तन का आकलन करने के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं। प्रत्येक तकनीक परिवर्तन प्रक्रिया के विशिष्ट पहलुओं का …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एजी प्रयोगशाला स्पेनिश परमाणु सुरक्षा परिषद द्वारा वित्त पोषित है । टीए और एजी जनरलिट डी कैटालुन्या (2017-एसजीआरआर-503) द्वारा मान्यता प्राप्त एक शोध समूह के सदस्य हैं। एमटी के पास साइंटिफिक फाउंडेशन एसोसिएन एस्पानोला कॉन्ट्रा एल कांसर [एईसीसी-इनव्से190222टीआर] द्वारा वित्त पोषित अनुबंध है। G.F. अनुबंध सेलेक्स फाउंडेशन से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित है ।
Materials
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage |
| 10 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glass bottle | With cap, autoclavable | ||
| 1000 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conical tubes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conical Tubes | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Used for anchorage assay |
| Anti-Claudin 4 antibody | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cell culture 24-well Plate | Labclinics | PLC30024 | Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom |
| Cell culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | Used for anchorage assay |
| Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2) | |||
| Cell Strainers | Fisherbrand | 11587522 | Mesh size: 40 μm |
| CellSense software | Olympus | Used to image acquisition | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Used to supplement cell culture medium |
| Class II Biological Safety Cabinet | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocal inverted Microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cover glasses | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, thickness 0.13 – 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | Used to inactivate trypsine action |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Free download, no license needed |
| Glass Pasteur Pipettes | |||
| Glass slides | Fisherbrand | 11844782 | |
| Goat Serum | Biowest | S2000 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Heat-Resistant Gloves | Used for agar manipulation after autoclave | ||
| Heater bath (37 ºC) | Used to temper solutions prior to cell subculture | ||
| Heater bath (42 ºC) | Used to keep agar warm | ||
| Heating plate | Used for Matrigel dehydration | ||
| Humid chamber | Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence | ||
| Ice | Used during Matrigel manipulation | ||
| Ice-box | |||
| Inverted Optic Microscope | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Micropipette | p1000, p200 and p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation |
| MilliQ water | Referred to as ultrapure water | ||
| Nail Polish | Used to seal samples after mounting | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Used to cover antibody solution during incubation |
| PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Used for cell subculture |
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 flasks | Corning | 353808 | Used for BPEC culture |
| Scepter Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20060 | Alternatively, use an haemocytometer |
| Scissors | Used to cut pipette tips and parafilm | ||
| Sterile filters 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | Used to filter MTT solution |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Store at -20 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Dilute in PBS to obtain 3X solution |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Used for primary BPEC culture |
| WIT-T Culture Medium | Stemgent | 00-0047 | Used for transformed BPEC culture |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).
- Schinzel, A. C., Hahn, W. C. Oncogenic transformation and experimental models of human cancer. Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71 (2008).
- Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nature Communications. 8 (1), 15422 (2017).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Ince, T. A., et al. Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes. Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).
- Repullés, J., et al. Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells. Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brocher, J. The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox. European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112 (2015).
- Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. Is random close packing of spheres well defined. Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis. Breast Cancer Research. 20 (1), 65 (2018).
