붉은털원숭이 지방유래 줄기세포의 분리, 증식 및 분화
Summary
이 기사에서는 효소 조직 소화 프로토콜을 사용하여 붉은털 원숭이 유래 지방 유래 줄기 세포(ADSC)의 분리에 대해 설명합니다. 다음으로, 세포 분리, 계수 및 도금을 포함하는 ADSC 증식에 대해 설명합니다. 마지막으로, ADSC 분화는 특정 지방 생성 유도제를 사용하여 설명됩니다. 또한 차별화를 확인하기 위한 염색 기술을 설명합니다.
Abstract
지방 조직은 자가 재생이 가능한 풍부하고 접근 가능한 다능성 줄기 세포 공급원을 제공합니다. 이러한 지방 유래 줄기 세포 (ADSC)는 생체 내 지방 세포와 기능적으로 유사한 일관된 생체 외 세포 시스템을 제공합니다. 생물 의학 연구에서 ADSC를 사용하면 지방 조직 대사 조절 및 기능에 대한 세포 조사가 가능합니다. ADSC 분화는 적절한 지방세포 확장을 위해 필요하며, 차선의 분화는 지방 기능 장애의 주요 메커니즘입니다. ADSC 분화의 변화를 이해하는 것은 대사 기능 장애 및 질병의 발병을 이해하는 데 중요합니다. 이 원고에 설명 된 프로토콜을 따를 때 포도당 섭취, 지방 분해, 지방 생성 및 분비를 측정하는 분석을 포함하되 이에 국한되지 않는 ADSC 대사 기능을 평가하기위한 여러 시험관 내 기능 테스트에 사용할 수있는 성숙한 지방 세포를 산출 할 것입니다. 붉은털 원숭이( Macaca mulatta) 는 생리학적, 해부학적, 진화적으로 인간과 유사하므로 그들의 조직과 세포는 생물 의학 연구 및 치료법 개발에 광범위하게 사용되었습니다. 여기에서는 4-9 세의 붉은 털 원숭이에서 얻은 신선한 피하 및 안타 지방 조직을 사용하여 ADSC 분리를 설명합니다. 지방 조직 샘플은 콜라게나제에서 효소적으로 분해된 후 여과 및 원심분리하여 기질 혈관 분획에서 ADSC를 분리합니다. 분리된 ADSC는 기질 배지에서 증식한 후 기질 배지에서 0.5μg/mL 덱사메타손, 0.5mM 이소부틸 메틸크산틴 및 50μM 인도메타신의 칵테일을 사용하여 약 14-21일 동안 분화합니다. 성숙한 지방 세포는 분화 약 14 일에 관찰됩니다. 이 원고에서는 ADSC 분리, 증식 및 시험관 내 분화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 붉은털 원숭이 지방 조직의 ADSC에 초점을 맞추었지만 이러한 프로토콜은 최소한의 조정으로 다른 동물로부터 얻은 지방 조직에 활용할 수 있습니다.
Introduction
지방 조직은 세포, 주로 성숙한 지방 세포 및 섬유 아세포, 면역 세포 및 지방 유래 줄기 세포 (ADSC)를 포함한 기질 혈관 분획의 이질적인 혼합물로 구성됩니다 1,2,3. 1 차 ADSC는 백색 지방 조직에서 직접 분리되고 지방 세포, 연골 또는 뼈 세포로 분화하도록 자극 될 수 있습니다4. ADSC는 시험관 내 다능성 유지 및자가 재생과 같은 고전적인 줄기 세포 특성을 나타냅니다. 그리고 문화에서 플라스틱을 고수합니다 5,6. ADSC는 다분화능과 비침습적 기술을 사용하여 대량으로 쉽게 수확할 수 있는 능력으로 인해 재생 의학에 사용되는 데 중요한 관심사입니다7. ADSC의 지방생성 분화는 지질 축적, 인슐린 자극 포도당 흡수, 지방 분해 및 아디포카인 분비8를 포함하는 성숙한 지방세포를 기능적으로 모방하는 세포를생성합니다. 성숙한 지방 세포와의 유사성은 지방 세포의 세포 특성 및 대사 기능의 생리 학적 조사를 위해 ADSC의 광범위한 사용으로 이어졌습니다. 대사 기능 장애 및 장애의 발달이 세포 또는 조직 수준 9,10,11,12에서 시작된다는 생각을 뒷받침하는 증거가 증가하고 있습니다. 최적의 ADSC 분화는 충분한 지방 조직 확장, 적절한 지방 세포 기능 및 효과적인 대사 조절을 위해 필요합니다13.
이 원고에 설명 된 프로토콜은 표준 실험실 장비와 기본 시약을 사용하는 간단한 기술입니다. 원고는 먼저 기계적 및 효소 적 소화를 사용하여 신선한 지방 조직에서 1 차 ADSC를 분리하기위한 프로토콜을 설명합니다. 다음으로, 기질 매질에서 ADSC의 증식 및 계대에 대한 프로토콜이 설명된다. 마지막으로, ADSC의 지방 생성 분화를위한 프로토콜이 설명된다. 분화 후, 이러한 세포는 지방 세포 대사 및 기능 장애 메커니즘을 더 잘 이해하기위한 연구에 사용될 수 있습니다. 오일 레드 O 및 붕소-디피로메텐(BODIPY) 염색을 사용한 지방생성 분화 및 지질 액적 검출의 확인을 위한 프로토콜이 또한 기재되어 있다. 이 프로토콜의 세부 사항은 붉은 털 원숭이의 신선한 omental 지방 조직에서 분리 된 1 차 ADSC에 중점을 두었습니다. 우리와 다른 사람들은 이 프로토콜을 사용하여 붉은털 원숭이 피하 및 안달 지방 조직 저장소14,15에서 ADSC를 성공적으로 분리했습니다. 사용 된 동일한 양의 조직에 대해, 우리는 피하 지방 조직이 omental 지방 조직에 비해 더 조밀하고 단단하며 소화에서 더 적은 세포를 생성한다는 것을 관찰했습니다. 이 프로토콜은 또한 인간 지방 샘플(16)로부터 ADSC를 단리하는데 사용되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
ADSC 분리, 증식 및 분화 프로토콜은 간단하고 재현 가능하지만 적절한 분리, 건강한 확장 및 효율적인 차별화를 보장하기 위해 신중한 기술이 필요합니다. 멸균 작업 환경은 모든 세포 배양 실험에 매우 중요합니다. 박테리아 또는 곰팡이는 오염된 도구, 배지 또는 작업 환경을 통해 세포 배양에 도입될 수 있습니다. 곰팡이 오염은 배양 물에서 포자 성장으로 표시되는 반면 박테리아 오염은 배지?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그의 기술 지원에 대해 Curtis Vande Stouwe에게 감사하고 싶습니다. 프로토콜 개발의 기초가되는 연구는 국립 알코올 남용 및 알코올 중독 연구소 (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 및 1F31AA028459-01)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
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