Isolierung, Proliferation und Differenzierung von Rhesusaffen-Fettstammzellen
Summary
In diesem Artikel beschreiben wir die Isolierung von aus Rhesusaffen gewonnenen Fettstammzellen (ADSCs) unter Verwendung eines enzymatischen Gewebeverdauungsprotokolls. Als nächstes beschreiben wir die ADSC-Proliferation, die Zellablösung, Zählen und Plattieren umfasst. Schließlich wird die ADSC-Differenzierung unter Verwendung spezifischer adipogener Induktoren beschrieben. Zusätzlich beschreiben wir Färbetechniken, um die Differenzierung zu bestätigen.
Abstract
Fettgewebe bietet eine reiche und zugängliche Quelle für multipotente Stammzellen, die sich selbst erneuern können. Diese aus Fett gewonnenen Stammzellen (ADSCs) bilden ein konsistentes ex vivo Zellsystem, das funktionell dem von in vivo Adipozyten ähnelt. Der Einsatz von ADSCs in der biomedizinischen Forschung ermöglicht die zelluläre Untersuchung der metabolischen Regulation und Funktion des Fettgewebes. Die ADSC-Differenzierung ist für eine adäquate Adipozytenexpansion notwendig, und die suboptimale Differenzierung ist ein wichtiger Mechanismus der Fettdysfunktion. Das Verständnis von Veränderungen in der ADSC-Differenzierung ist entscheidend für das Verständnis der Entwicklung von metabolischen Dysfunktionen und Erkrankungen. Die in diesem Manuskript beschriebenen Protokolle ergeben, wenn sie befolgt werden, reife Adipozyten, die für mehrere In-vitro-Funktionstests zur Beurteilung der ADSC-Stoffwechselfunktion verwendet werden können, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Assays zur Messung der Glukoseaufnahme, Lipolyse, Lipogenese und Sekretion. Rhesusaffen (Macaca mulatta) sind physiologisch, anatomisch und evolutionär dem Menschen ähnlich und als solche wurden ihre Gewebe und Zellen ausgiebig in der biomedizinischen Forschung und zur Entwicklung von Behandlungen verwendet. Hier beschreiben wir die ADSC-Isolierung mit frischem subkutanem und omentalem Fettgewebe, das von 4-9-jährigen Rhesusaffen gewonnen wird. Fettgewebeproben werden enzymatisch in Kollagenase verdaut, gefolgt von Filtration und Zentrifugation, um ADSCs aus der stromalen Gefäßfraktion zu isolieren. Isolierte ADSCs werden in stromalen Medien proliferiert, gefolgt von etwa 14-21 Tagen Differenzierung unter Verwendung eines Cocktails aus 0,5 μg / ml Dexamethason, 0,5 mM Isobutylmethylxanthin und 50 μM Indomethacin in stromalen Medien. Reife Adipozyten werden nach etwa 14 Tagen der Differenzierung beobachtet. In diesem Manuskript beschreiben wir Protokolle für die Isolierung, Proliferation und Differenzierung von ADSC in vitro. Obwohl wir uns auf ADSCs aus Rhesusaffen-Fettgewebe konzentriert haben, können diese Protokolle für Fettgewebe verwendet werden, das von anderen Tieren mit minimalen Anpassungen gewonnen wird.
Introduction
Fettgewebe besteht aus einer heterogenen Mischung von Zellen, überwiegend reifen Adipozyten und einer stromalen vaskulären Fraktion einschließlich Fibroblasten, Immunzellen und aus Fett gewonnenen Stammzellen (ADSCs)1,2,3. Primäre ADSCs können direkt aus weißem Fettgewebe isoliert und zur Differenzierung in Adipozyten, Knorpel- oder Knochenzellen angeregt werden4. ADSCs weisen klassische Stammzelleigenschaften wie die Aufrechterhaltung der Multipotenz in vitro und die Selbsterneuerung auf; und haften an Kunststoff in Kultur 5,6. ADSCs sind aufgrund ihrer Multipotenz und der Fähigkeit, mit nicht-invasiven Techniken leicht in großen Mengen geerntet zu werden 7, von großem Interessefür den Einsatz in der regenerativen Medizin. Die adipogene Differenzierung von ADSCs erzeugt Zellen, die funktionell reife Adipozyten nachahmen, einschließlich Lipidakkumulation, insulinstimulierter Glukoseaufnahme, Lipolyse und Adipokinsekretion8. Ihre Ähnlichkeit mit reifen Adipozyten hat zur weit verbreiteten Verwendung von ADSCs zur physiologischen Untersuchung der zellulären Eigenschaften und der metabolischen Funktion von Adipozyten geführt. Es gibt zunehmend Hinweise auf die Idee, dass die Entwicklung von metabolischen Dysfunktionen und Störungen auf zellulärer oder Gewebeebene ihren Ursprung hat 9,10,11,12. Eine optimale ADSC-Differenzierung ist für eine ausreichende Fettgewebeexpansion, eine ordnungsgemäße Adipozytenfunktion und eine effektive metabolische Regulation erforderlich13.
Die in diesem Manuskript beschriebenen Protokolle sind einfache Techniken, die Standardlaborgeräte und grundlegende Reagenzien verwenden. Das Manuskript beschreibt zunächst das Protokoll zur Isolierung von primären ADSCs aus frischem Fettgewebe mittels mechanischer und enzymatischer Verdauung. Als nächstes wird das Protokoll für die Proliferation und das Passaging von ADSCs in Stromamedium beschrieben. Schließlich wird das Protokoll für die adipogene Differenzierung von ADSCs beschrieben. Nach der Differenzierung können diese Zellen für Studien verwendet werden, um den Adipozytenstoffwechsel und die Mechanismen der Dysfunktion besser zu verstehen. Die Protokolle zur Bestätigung der adipogenen Differenzierung und des Lipidtröpfchennachweises unter Verwendung von Ölrot-O und Bor-Dipyrromethen-Färbung (BODIPY) werden ebenfalls beschrieben. Die Details dieser Protokolle konzentrierten sich auf primäre ADSCs, die aus frischem omentalem Fettgewebe von Rhesusaffen isoliert wurden. Wir und andere haben dieses Protokoll verwendet, um erfolgreich ADSCs aus Rhesusaffen subkutanen und omentalen Fettgewebedepots zu isolieren14,15. Für die gleiche Menge an verwendetem Gewebe haben wir beobachtet, dass subkutanes Fettgewebe dichter und zäher ist und im Vergleich zu omentalem Fettgewebe weniger Zellen aus der Verdauung liefert. Dieses Protokoll wurde auch verwendet, um ADSCs aus menschlichen Fettproben zu isolieren16.
Protocol
Representative Results
Discussion
ADSC-Isolations-, Proliferations- und Differenzierungsprotokolle sind einfach und reproduzierbar, erfordern jedoch eine sorgfältige Technik, um eine angemessene Isolierung, gesunde Expansion und effiziente Differenzierung zu gewährleisten. Eine sterile Arbeitsumgebung ist für alle Zellkulturexperimente von entscheidender Bedeutung. Bakterien oder Pilze können durch kontaminierte Werkzeuge, Medien oder Arbeitsumgebungen in Zellkulturen eingeführt werden. Pilzkontamination wird durch Sporenwachstum in der Kultur angez…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Curtis Vande Stouwe für seine technische Unterstützung. Die Forschung, die der Entwicklung der Protokolle zugrunde liegt, wurde durch Zuschüsse des Nationalen Instituts für Alkoholmissbrauch und Alkoholismus unterstützt (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 und 1F31AA028459-01).
Materials
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
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