恒河猴脂肪干细胞的分离、增殖和分化
Summary
在本文中，我们描述了使用酶组织消化方案分离恒河猴衍生的脂肪来源干细胞（ADSC）。接下来，我们描述ADSC增殖，包括细胞分离，计数和电镀。最后，使用特定的成脂诱导剂描述ADSC分化。此外，我们描述了染色技术以确认差异化。
Abstract
脂肪组织提供了丰富且易于获得的多能干细胞来源，这些干细胞能够自我更新。这些脂肪来源的干细胞（ADSC）提供一致的离体细胞系统，其功能与体内脂肪细胞相似。在生物医学研究中使用ADSC可以对脂肪组织代谢调节和功能进行细胞研究。ADSC分化是充分扩增脂肪细胞所必需的，次优分化是脂肪功能障碍的主要机制。了解ADSC分化的变化对于了解代谢功能障碍和疾病的发展至关重要。遵循本手稿中描述的方案将产生成熟的脂肪细胞，可用于多种体外功能测试，以评估ADSC代谢功能，包括但不限于测量葡萄糖摄取，脂肪分解，脂肪生成和分泌的测定。恒河猴 （Macaca mulatta） 在生理学、解剖学和进化上与人类相似，因此，它们的组织和细胞已广泛用于生物医学研究和治疗开发。在这里，我们描述了使用从4-9岁恒河猴获得的新鲜皮下和网膜脂肪组织进行ADSC分离。脂肪组织样品在胶原酶中酶解，然后过滤和离心以从基质血管组分中分离ADSC。分离的ADSC在基质培养基中增殖，然后在基质培养基中使用0.5μg/mL地塞米松、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤和50μM吲哚美辛的混合物进行约14-21天的分化。在分化约14天时观察到成熟的脂肪细胞。在这篇手稿中，我们描述了ADSC体外分离、增殖和分化的方案。虽然，我们专注于来自恒河猴脂肪组织的ADSC，但这些协议可用于从其他动物获得的脂肪组织，只需最少的调整。
Introduction
脂肪组织由细胞、主要成熟的脂肪细胞和基质血管部分（包括成纤维细胞、免疫细胞和脂肪来源的干细胞 （ADSC））的异质混合物组成1，2，3。原代ADSC可以直接从白色脂肪组织中分离出来，并刺激分化成脂肪细胞、软骨或骨细胞4。ADSCs表现出经典的干细胞特性，例如维持体外多能性和自我更新;并在文化中坚持塑料5，6。ADSCs因其多能性和使用非侵入性技术轻松大量收获的能力而对再生医学的使用具有重要意义7。ADSC的成脂分化产生功能上模仿成熟脂肪细胞的细胞，包括脂质积累，胰岛素刺激的葡萄糖摄取，脂肪分解和脂肪因子分泌8。它们与成熟脂肪细胞的相似性导致ADSC广泛用于脂肪细胞的细胞特征和代谢功能的生理研究。越来越多的证据支持代谢功能障碍和紊乱的发展起源于细胞或组织水平的观点9，10，11，12。最佳的ADSC分化是充分脂肪组织扩张，适当的脂肪细胞功能和有效代谢调节所必需的13。
本手稿中描述的方案是使用标准实验室设备和基本试剂的简单技术。手稿首先描述了使用机械和酶消化从新鲜脂肪组织中分离原代ADSC的方案。接下来，描述了ADSCs在基质培养基中的增殖和传代方案。最后，描述了ADSCs的成脂分化方案。分化后，这些细胞可用于研究，以更好地了解脂肪细胞代谢和功能障碍机制。还描述了使用油红O和硼-二吡咯甲烷（BODIPY）染色确认脂肪分化和脂滴检测的方案。这些方案的细节集中在从恒河猴的新鲜网膜脂肪组织中分离的原代ADSC。我们和其他人已经使用该协议成功地从恒河猴皮下和网膜脂肪组织库14，15中分离出ADSC。对于使用相同数量的组织，我们观察到与网膜脂肪组织相比，皮下脂肪组织更致密，更坚韧，并且从消化中产生的细胞更少。该协议还用于从人类脂肪样品中分离ADSC16。
Protocol
Representative Results
Discussion
ADSC分离、增殖和分化方案简单易用且可重现，但需要谨慎的技术来确保充分分离、健康扩增和高效分化。无菌的工作环境对于所有细胞培养实验都至关重要。细菌或真菌可能通过受污染的工具、培养基或工作环境引入细胞培养物中。真菌污染由培养物中的孢子生长指示，而细菌污染由培养基浑浊的存在表示。我们建议在使用前对生物安全柜和所有移液器、瓶子和工具进行消毒，在使用生物安全柜…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢Curtis Vande Stouwe的技术援助。协议开发的基础研究得到了国家酒精滥用和酒精中毒研究所（5P60AA009803-25，5T32AA007577-20和1F31AA028459-01）的资助。
Materials
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
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