रीसस मकाक वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं का अलगाव, प्रसार और भेदभाव
Summary
इस लेख में, हम एक एंजाइमेटिक ऊतक पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग करके रीसस मकाक व्युत्पन्न वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एडीएससी) के अलगाव का वर्णन करते हैं। इसके बाद, हम एडीएससी प्रसार का वर्णन करते हैं जिसमें सेल डिटेचमेंट, गिनती और चढ़ाना शामिल है। अंत में, एडीएससी भेदभाव को विशिष्ट एडिपोजेनिक उत्प्रेरण एजेंटों का उपयोग करके वर्णित किया गया है। इसके अतिरिक्त, हम भेदभाव की पुष्टि करने के लिए धुंधला तकनीकों का वर्णन करते हैं।
Abstract
वसा ऊतक मल्टीपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का एक समृद्ध और सुलभ स्रोत प्रदान करता है, जो आत्म-नवीनीकरण करने में सक्षम हैं। ये वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल (एडीएससी) एक सुसंगत पूर्व विवो सेलुलर प्रणाली प्रदान करते हैं जो कार्यात्मक रूप से विवो एडिपोसाइट्स की तरह होते हैं। बायोमेडिकल अनुसंधान में एडीएससी का उपयोग वसा ऊतक चयापचय विनियमन और कार्य की सेलुलर जांच के लिए अनुमति देता है। एडीएससी भेदभाव पर्याप्त एडिपोसाइट्स विस्तार के लिए आवश्यक है, और उप-मानक भेदभाव वसा शिथिलता का एक प्रमुख तंत्र है। एडीएससी भेदभाव में परिवर्तन को समझना चयापचय शिथिलता और बीमारी के विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल, जब पालन किया जाता है, तो परिपक्व एडिपोसाइट्स उत्पन्न होंगे जिनका उपयोग एडीएससी चयापचय समारोह का आकलन करने के लिए कई इन विट्रो कार्यात्मक परीक्षणों के लिए किया जा सकता है, जिसमें ग्लूकोज अपटेक, लिपोलिसिस, लिपोजेनेसिस और स्राव को मापने के लिए सीमित नहीं है। रीसस मकाक (मकाका मुलाटा) शारीरिक रूप से, शारीरिक रूप से और विकासवादी रूप से मनुष्यों के समान हैं और इस तरह, उनके ऊतकों और कोशिकाओं का उपयोग जैव चिकित्सा अनुसंधान और उपचार के विकास के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। यहां, हम 4-9 वर्षीय रीसस मकाक से प्राप्त ताजा चमड़े के नीचे और ओमेंटल वसा ऊतक का उपयोग करके एडीएससी अलगाव का वर्णन करते हैं। वसा ऊतक के नमूने कोलेजनेज में एंजाइमेटिक रूप से पच जाते हैं, जिसके बाद स्ट्रोमल संवहनी अंश से एडीएससी को अलग करने के लिए निस्पंदन और सेंट्रीफ्यूजेशन होता है। स्ट्रोमल मीडिया में पृथक एडीएससी का प्रसार होता है, जिसके बाद 0.5 μg / mL dexamethasone, 0.5 mM isobutyl methylxanthine, और स्ट्रोमल मीडिया में 50 μM इंडोमेथासिन के कॉकटेल का उपयोग करके लगभग 14-21 दिनों का भेदभाव होता है। परिपक्व एडिपोसाइट्स लगभग 14 दिनों के भेदभाव पर देखे जाते हैं। इस पांडुलिपि में, हम इन विट्रो में एडीएससी अलगाव, प्रसार और भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हालांकि, हमने रीसस मकाक वसा ऊतक से एडीएससी पर ध्यान केंद्रित किया है, इन प्रोटोकॉल का उपयोग न्यूनतम समायोजन के साथ अन्य जानवरों से प्राप्त वसा ऊतक के लिए किया जा सकता है।
Introduction
वसा ऊतक में कोशिकाओं का एक विषम मिश्रण होता है, मुख्य रूप से परिपक्व एडिपोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एडीएससी) 1,2,3 सहित एक स्ट्रोमल संवहनी अंश। प्राथमिक एडीएससी को सीधे सफेद वसा ऊतक से अलग किया जा सकता है और एडिपोसाइट्स, उपास्थि या हड्डी की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए उत्तेजित कियाजा सकता है। एडीएससी शास्त्रीय स्टेम सेल विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं जैसे कि विट्रो में मल्टीपोटेंसी का रखरखाव और आत्म-नवीकरण; और संस्कृति 5,6 में प्लास्टिक के अनुयायी हैं। एडीएससी पुनर्योजी चिकित्सा में उपयोग के लिए महत्वपूर्ण रुचि रखते हैं क्योंकि उनकी बहुशक्ति और गैर-इनवेसिवतकनीकों का उपयोग करके बड़ी मात्रा में आसानी से काटने की क्षमता है। एडीएससी का एडिपोजेनिक भेदभाव कोशिकाओं का उत्पादन करता है जो कार्यात्मक रूप से परिपक्व एडिपोसाइट्स की नकल करते हैं जिनमें लिपिड संचय, इंसुलिन-उत्तेजित ग्लूकोज अपटेक, लिपोलिसिस और एडिपोकिन स्रावशामिल हैं। परिपक्व एडिपोसाइट्स के साथ उनकी समानता ने सेलुलर विशेषताओं की शारीरिक जांच और एडिपोसाइट्स के चयापचय कार्य के लिए एडीएससी के व्यापक उपयोग को जन्म दिया है। इस विचार का समर्थन करने वाले सबूत बढ़ रहे हैं कि चयापचय शिथिलता और विकारों का विकास सेलुलर या ऊतक स्तर 9,10,11,12 पर उत्पन्न होता है। पर्याप्त वसा ऊतक विस्तार, उचित एडिपोसाइट्स फ़ंक्शन और प्रभावी चयापचय विनियमन13 के लिए इष्टतम एडीएससी भेदभाव की आवश्यकता होती है।
इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल मानक प्रयोगशाला उपकरण और बुनियादी अभिकर्मकों का उपयोग करने वाली सीधी तकनीकें हैं। पांडुलिपि पहले यांत्रिक और एंजाइमेटिक पाचन का उपयोग करके ताजा वसा ऊतक से प्राथमिक एडीएससी के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। इसके बाद, स्ट्रोमल माध्यम में एडीएससी के प्रसार और पासिंग के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। अंत में, एडीएससी के एडिपोजेनिक भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। भेदभाव के बाद, इन कोशिकाओं का उपयोग एडिपोसाइट चयापचय और शिथिलता के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए अध्ययन के लिए किया जा सकता है। ऑयल रेड ओ और बोरॉन-डिपिरोमेथेन (बीओडीआईपीवाई) धुंधला होने का उपयोग करके एडिपोजेनिक भेदभाव और लिपिड बूंद का पता लगाने की पुष्टि के लिए प्रोटोकॉल भी वर्णित हैं। इन प्रोटोकॉल का विवरण रीसस मकाक के ताजा ओमेंटल वसा ऊतक से अलग प्राथमिक एडीएससी पर केंद्रित था। हमने और अन्य लोगों ने रीसस मकाक चमड़े के नीचे और ओमेंटल वसा ऊतक डिपो14,15 से एडीएससी को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है। उपयोग किए गए ऊतक की समान मात्रा के लिए, हमने देखा है कि चमड़े के नीचे वसा ऊतक अधिक घना, कठिन होता है और ओमेंटल वसा ऊतक की तुलना में पाचन से कम कोशिकाओं का उत्पादन करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग एडीएससी को मानव वसा के नमूने16 से अलग करने के लिए भी किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एडीएससी अलगाव, प्रसार और भेदभाव प्रोटोकॉल सीधे-आगे और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, लेकिन उन्हें पर्याप्त अलगाव, स्वस्थ विस्तार और कुशल भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक तकनीक की आवश्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अपनी तकनीकी सहायता के लिए कर्टिस वंदे स्टोव को धन्यवाद देना चाहते हैं। प्रोटोकॉल के अंतर्निहित अनुसंधान विकास को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन अल्कोहल एब्यूज एंड अल्कोहलिज्म (5पी 60एए009803-25, 5टी32एए007577-20 और 1एफ31एए028459-01) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
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