Isolering, proliferasjon og differensiering av Rhesus Macaque fettavledede stamceller

Summary

I denne artikkelen beskriver vi isolering av rhesus macaque derived adipose-derived stem cells (ADSCs) ved hjelp av en enzymatisk vevsfordøyelsesprotokoll. Deretter beskriver vi ADSC-spredning som inkluderer celleløsning, telling og plating. Til slutt beskrives ADSC-differensiering ved bruk av spesifikke adipogene induserende midler. I tillegg beskriver vi fargeteknikker for å bekrefte differensiering.

Abstract

Fettvev gir en rik og tilgjengelig kilde til multipotente stamceller, som er i stand til å fornye seg selv. Disse fettavledede stamcellene (ADSC) gir et konsistent ex vivo cellulært system som er funksjonelt som for in vivo adipocytter. Bruk av ADSC-er i biomedisinsk forskning muliggjør cellulær undersøkelse av fettvevets metabolske regulering og funksjon. ADSC-differensiering er nødvendig for adekvat adipocyttekspansjon, og suboptimal differensiering er en viktig mekanisme for fettdysfunksjon. Å forstå endringer i ADSC-differensiering er avgjørende for å forstå utviklingen av metabolsk dysfunksjon og sykdom. Protokollene beskrevet i dette manuskriptet, når de følges, vil gi modne adipocytter som kan brukes til flere in vitro funksjonstester for å vurdere ADSC metabolsk funksjon, inkludert men ikke begrenset til analyser som måler glukoseopptak, lipolyse, lipogenese og sekresjon. Rhesus macaques (Macaca mulatta) er fysiologisk, anatomisk og evolusjonært lik mennesker, og som sådan har deres vev og celler blitt brukt mye i biomedisinsk forskning og for utvikling av behandlinger. Her beskriver vi ADSC-isolering ved bruk av ferskt subkutant og omentalt fettvev fra 4–9 år gamle rhesusmakaker. Fettvevsprøver fordøyes enzymatisk i kollagenase etterfulgt av filtrering og sentrifugering for å isolere ADSC fra stromal vaskulær fraksjon. Isolerte ADSC-er prolifereres i stromale medier etterfulgt av ca. 14–21 dagers differensiering ved bruk av en cocktail på 0,5 μg/ml deksametason, 0,5 mM isobutylmetylxanthin og 50 μM indometacin i stromale medier. Eldre adipocytter observeres ved ca. 14 dagers differensiering. I dette manuskriptet beskriver vi protokoller for ADSC-isolering, proliferasjon og differensiering in vitro. Selv om vi har fokusert på ADSC-er fra rhesus macaque fettvev, kan disse protokollene brukes til fettvev hentet fra andre dyr med minimale justeringer.

Introduction

Fettvev består av en heterogen blanding av celler, hovedsakelig modne adipocytter og en stromal vaskulær fraksjon inkludert fibroblaster, immunceller og fettavledede stamceller (ADSC)^1,2,3. Primære ADSC-er kan isoleres direkte fra hvitt fettvev og stimuleres til å differensiere til adipocytter, brusk eller beinceller⁴. ADSC-er utviser klassiske stamcelleegenskaper som vedlikehold av multipotens in vitro og selvfornyelse; og er tilhenger av plast i kultur ^5,6. ADSC er av viktig interesse for bruk i regenerativ medisin på grunn av deres multipotens og evne til lett å høstes i store mengder ved hjelp av ikke-invasive teknikker⁷. Adipogen differensiering av ADSC produserer celler som funksjonelt etterligner modne adipocytter, inkludert lipidakkumulering, insulinstimulert glukoseopptak, lipolyse og adipokinsekresjon⁸. Deres likhet med modne adipocytter har ført til utbredt bruk av ADSC for fysiologisk undersøkelse av cellulære egenskaper og metabolsk funksjon av adipocytter. Det er økende bevis som støtter ideen om at utviklingen av metabolsk dysfunksjon og lidelser stammer fra celle- eller vevsnivå 9,10,11,12. Optimal ADSC-differensiering er nødvendig for tilstrekkelig fettvevsutvidelse, riktig adipocyttfunksjon og effektiv metabolsk regulering¹³.

Protokoller beskrevet i dette manuskriptet er enkle teknikker som benytter standard laboratorieutstyr og grunnleggende reagenser. Manuskriptet beskriver først protokollen for isolering av primære ADSC-er fra ferskt fettvev ved bruk av mekanisk og enzymatisk fordøyelse. Deretter beskrives protokollen for spredning og passasjering av ADSC-er i stromalt medium. Til slutt beskrives protokollen for adipogen differensiering av ADSC. Etter differensiering kan disse cellene brukes til studier for bedre å forstå adipocytmetabolisme og mekanismer for dysfunksjon. Protokollene for bekreftelse av adipogen differensiering og påvisning av lipiddråper ved bruk av oljerød O og bor-dipyrrometen (BODIPY) farging er også beskrevet. Detaljene i disse protokollene fokuserte på primære ADSC-er isolert fra ferskt omentalt fettvev av rhesusmakaker. Vi og andre har brukt denne protokollen til å isolere ADSC-er fra rhesus macaque subkutane og omentale fettvevdepoter^14,15. For samme mengde vev som brukes, har vi observert at subkutant fettvev er tettere, tøffere og gir mindre celler fra fordøyelsen sammenlignet med omentalt fettvev. Denne protokollen har også blitt brukt til å isolere ADSC-er fra humane fettprøver¹⁶.

Protocol

Alle oppnådde vev og prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Louisiana State University Health Sciences Center og ble utført i samsvar med retningslinjene fra National Institute of Health (NIH-publikasjon nr. 85-12, revidert 1996). 1. Fremstilling av buffere og løsninger Klargjør steril 5-fosfatbufret saltvannsvaskebuffer (5-PBS) løsning ved å tilsette 5% penicillin / streptomycin (penn / strep) og 0,25 μg / ml sopphemmer til 1x PBS. Klargjø…

Representative Results

ADSC-ene isolert fra rhesus macaque fettvevsprøver ble sådd på dyrkningsplater og er vist i figur 1. På pletteringsdagen er cellene ikke-klebende og flyter i kulturskålen som vist i figur 1A. Innen 72 timer vil ADSC-er bli 80% sammenflytende og er klare for adipocytdifferensiering (figur 1B). ADSC-er utviser sterke adipogene egenskaper etter kjemisk induksjon. Etter 14 dagers differensiering kan modne adipocytter observeres via…

Discussion

ADSC-isolasjons-, sprednings- og differensieringsprotokoller er rett frem og reproduserbare, men de krever nøye teknikk for å sikre tilstrekkelig isolasjon, sunn ekspansjon og effektiv differensiering. Et sterilt arbeidsmiljø er kritisk for alle cellekultureksperimenter. Bakterier eller sopp kan bli introdusert i cellekulturer gjennom forurensede verktøy, media eller arbeidsmiljø. Svampkontaminering indikeres av sporevekst i kulturen, mens bakteriell forurensning indikeres av tilstedeværelsen av turbiditet i media….

Materials

0.4 % trypan blue	Thermo-Fisher	15250061
1.5-ml microcentrifuge tube	Dot Scientific	707-FTG
100 % isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1838-P
100-mm cell culture dish	Corning	430167
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018
50-mL plastic conical tube	Fisher Scientific	50-465-232
70-µm cell strainer	Corning	CLS431751
a-MEM	Thermo-Fisher	12561056
Aluminum foil	Reynolds Wrap
BODIPY	Thermo-Fisher	D3922
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	05470
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Collagenase, Type I	Thermo-Fisher	17100017
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma-Aldrich	D2915
Dimethyl sulfoxide, DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Distilled water	Thermo-Fisher	15230162
Fetal Bovine Serum, USDA-approved	Sigma-Aldrich	F0926
Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL)	Thermo-Fisher	15290018
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14175095
Hemacytometer with cover slip	Sigma-Aldrich	Z359629
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
Inverted light microscope	Nikon	DIAPHOT-TMD
L-glutamine (200 mM)	Thermo-Fisher	25030081
Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz	Reliable Scientific	Model 55 Rocking
Neutral buffered formalin (10 %)	Pharmco	8BUFF-FORM
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
Paraformeldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo-Fisher	15140122
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo-Fisher	10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer	Qiagen	158904
Serological pipettes, 2 to 25 mL	Costar Stripettes
Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2	Sanyo	MCO-17AIC
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo-Fisher	25200056