Un modèle d’AVC photothrombotique enrichi en fibrine et sensible au tPA

Summary

Les modèles traditionnels d’AVC photothrombotique (PTS) induisent principalement des agrégats plaquettaires denses d’une haute résistance au traitement lytique par activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Ici, un modèle PTS murin modifié est introduit en co-injectant de la thrombine et un colorant photosensible pour la photoactivation. Le modèle PTS amélioré par la thrombine produit des caillots mixtes plaquettaire/fibrine et est très sensible à la thrombolyse tPA.

Abstract

Un modèle idéal d’AVC thromboembolique nécessite certaines propriétés, notamment des procédures chirurgicales relativement simples avec une faible mortalité, une taille et une localisation d’infarctus constantes, une précipitation de caillots sanguins mélangés plaquettaire/fibrine similaires à ceux des patients, et une sensibilité adéquate au traitement fibrinolytique. Le modèle d’AVC photothrombotique à base de colorant rose bengale (RB) répond aux deux premières exigences, mais est hautement réfractaire au traitement lytique médié par le tPA, probablement en raison de sa composition en caillots riche en plaquettes, mais pauvre en fibrine. Nous pensons que la combinaison d’un colorant RB (50 mg/kg) et d’une dose sub-thrombotique de thrombine (80 U/kg) pour la photoactivation visant la branche proximale de l’artère cérébrale moyenne (MCA) peut produire des caillots enrichis en fibrine et sensibles au tPA. En effet, le modèle de photothrombose combinée à la thrombine et à la RB (T+RB) a déclenché des caillots sanguins mixtes plaquette/fibrine, comme le montrent l’immunomarquage et les immunoblots, et a maintenu des tailles et des emplacements d’infarctus constants ainsi qu’une faible mortalité. De plus, l’injection intraveineuse de tPA (Alteplase, 10 mg/kg) dans les 2 heures suivant la photoactivation a significativement diminué la taille de l’infarctus dans la photothrombose T+RB. Ainsi, le modèle d’AVC photothrombotique amélioré par la thrombine peut être un modèle expérimental utile pour tester de nouvelles thérapies thrombolytiques.

Introduction

La thrombectomie endovasculaire et la thrombolyse médiée par tPA sont les deux seules thérapies approuvées par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour l’AVC ischémique aigu, qui touche ~700 000 patients chaque année aux États-Unis¹. Étant donné que l’application de la thrombectomie est limitée à l’occlusion des gros vaisseaux (LVO), alors que la thrombolyse tPA peut soulager les occlusions des petits vaisseaux, les deux sont des thérapies précieuses de l’AVC ischémique aigu². De plus, la combinaison des deux thérapies (p. ex., l’initiation de la thrombolyse tPA dans les 4,5 heures suivant le début de l’AVC, suivie d’une thrombectomie) améliore la reperfusion et les résultats fonctionnels³. Ainsi, l’optimisation de la thrombolyse reste un objectif important pour la recherche sur l’AVC, même à l’ère de la thrombectomie.

Les modèles thromboemboliques sont un outil essentiel pour la recherche préclinique sur l’AVC visant à améliorer les thérapies thrombolytiques. Cela est dû au fait que les modèles d’occlusion vasculaire mécanique (par exemple, l’occlusion MCA de suture intraluminale) ne produisent pas de caillots sanguins et que la récupération rapide du flux sanguin cérébral après l’ablation de l’occlusion mécanique est trop idéalisée ^4,5. À ce jour, les principaux modèles thromboemboliques comprennent la photothrombose ^6,7,8, l’application topique de chlorure ferrique (FeCl₃)⁹, la micro-injection de thrombine dans la branche MCA 10,11, l’injection ex vivo de (micro)emboles dans le MCA ou l’artère carotide commune (ACC)12,13,14 et l’hypoxie-ischémie transitoire (tHI)^{15,16, Chapitre 17 et 18}. Ces modèles d’AVC diffèrent par la composition histologique des caillots qui en résultent et la sensibilité aux thérapies lytiques médiées par le tPA (tableau 1). Ils varient également en ce qui concerne l’exigence chirurgicale de la craniotomie (nécessaire pour l’injection in situ de thrombine et l’application topique de FeCl₃), la constance de la taille et de la localisation de l’infarctus (par exemple, la perfusion d’ACC de microemboles donne des résultats très variables) et les effets globaux sur le système cardiovasculaire (par exemple, l’IHI augmente la fréquence cardiaque et le débit cardiaque pour compenser la vasodilatation périphérique induite par l’hypoxie).

Le modèle d’AVC photothrombotique (PTS) basé sur le colorant RB présente de nombreuses caractéristiques intéressantes, notamment des procédures chirurgicales simples sans craniotomie, une faible mortalité (généralement < 5 %) et une taille et une localisation prévisibles de l’infarctus (dans le territoire fournissant l’ACM), mais il présente deux limites majeures. ⁸ La première mise en garde est la réponse faible à nulle au traitement thrombolytique médié par le tPA, ce qui est également un inconvénient du modèle FeCl₃ ^7,19,20. La deuxième mise en garde des modèles d’AVC PTS et FeCl₃ est que les thrombus qui en résultent sont constitués d’agrégats plaquettaires densément emballés avec une petite quantité de fibrine, ce qui non seulement conduit à sa résilience au traitement tPA-lytique, mais s’écarte également du modèle de thrombus plaquettaire/fibrine mélangés chez les patients ayant subi un AVC ischémique aigu^21,22. En revanche, le modèle de thrombine-microinjection in situ comprend principalement de la fibrine polymérisée et une teneur incertaine en plaquettes¹⁰.

Compte tenu du raisonnement ci-dessus, nous avons émis l’hypothèse que l’association de RB et d’une dose sous-thrombotique de thrombine pour la photoactivation ciblée par l’ACM à travers un crâne aminci peut augmenter la composante fibrine dans les thrombus résultants et augmenter la sensibilité au traitement lytique médié par tPA. Nous avons confirmé cette ^hypothèse23 et nous décrivons ici en détail les procédures du modèle d’AVC photothrombotique modifié (T+RB).

Protocol

Ce protocole est approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Virginie et suit les lignes directrices des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. La figure 1A décrit la séquence des interventions chirurgicales de ce protocole. 1. Configuration de la chirurgie Placez un coussin chauffant avec une température réglée à 37 °C sur l’adaptateur pour petit …

Representative Results

Tout d’abord, nous avons comparé la teneur en fibrine dans les caillots sanguins induits par la photothrombose RB par rapport à T+RB. Des souris ont été sacrifiées par perfusion transcardique de fixateurs 2 h après la photoactivation, et des cerveaux ont été prélevés pour la coloration par immunofluorescence de la branche MCA dans les plans longitudinaux et transversaux. Dans la photothrombose RB, la branche MCA était densément remplie de plaquettes CD41+ et de peu de fibrine (<strong class="xfig…

Discussion

L’AVC photothrombotique RB traditionnel, introduit en 1985, est un modèle attrayant d’ischémie cérébrale focale pour les interventions chirurgicales simples, la faible mortalité et la reproductibilité élevée de l’infarctus cérébral. ⁵ Dans ce modèle, le colorant photodynamique RB active rapidement les plaquettes lors de l’excitation lumineuse, conduisant à des agrégats denses qui occlus le vaisseau sanguin ^5,8,23.<sup …

Materials

2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877	infarct
4-0 Nylon monofilament suture	LOOK	766B	surgical supplies
5-0 silk suture	Harvard Apparatus	624143	surgical supplies
543nm laser beam	Melles Griot	25-LGP-193-249	photothrombosis
adult male mice	Charles River	C57BL/6	10~14 weeks old (22~30 g)
Anesthesia bar for mouse adaptor	machine shop, UVA		surgical setup
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)	Sigma	T48402	euthanasia
Dental drill	Dentamerica	Rotex 782	surgical setup
Digital microscope	Dino-Lite	AM2111	brain imaging
Dissecting microscope	Olympus	SZ40	surgical setup
Fine curved forceps (serrated)	FST	11370-31	surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)	FST	11373-12	surgical instrument
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	Immunohistochemistry
Halsted-Mosquito hemostats	FST	13008-12	surgical instrument
Heat pump with warming pad	Gaymar	TP700	surgical setup
infusion pump	KD Scientific	200	thrombolytic treatment
Insulin syringe with 31G needle	BD	328291	photothrombosis
Ketamine	CCM, UVA		anesthesia
Laser protective google 532nm	Thorlabs	LG3	photothrombosis
Meloxicam SR	CCM, UVA		NSAID analgesia
micro needle holders	FST	12060-01	surgical instrument
micro scissors	FST	15000-03	surgical instrument
MoorFLPI-2 blood flow imager	Moor	780-nm laser source	Laser Speckle Contrast Imaging
Mouse adaptor	RWD	68014	surgical setup
Puralube Vet ointment	Fisher	NC0138063	eye dryness prevention
Retractor tips	Kent Scientific	Surgi-5014-2	surgical setup
Rose Bengal	Sigma	198250	photothrombosis
Thrombin	Sigma	T7513	photothrombosis
Tissue glue	Abbott Laboratories	NC9855218	surgical supplies
tPA	Genetech	Cathflo activase 2mg	thrombolytic treatment
Vibratome	Stoelting	51425	TTC infacrt
Xylazine	CCM, UVA		anesthesia