Summary

Un modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico enriquecido con fibrina y sensible al tPA

Published: June 04, 2021
doi:

Summary

Los modelos tradicionales de ictus fototrombótico (SPT) inducen principalmente agregados plaquetarios densos de alta resistencia al tratamiento lítico con activadores tisulares del plasminógeno (tPA). Aquí se introduce un modelo de PTS murino modificado mediante la coinyección de trombina y colorante fotosensible para la fotoactivación. El modelo de SPT potenciado con trombina produce coágulos mixtos de plaquetas:fibrina y es muy sensible a la trombólisis tPA.

Abstract

Un modelo ideal de accidente cerebrovascular tromboembólico requiere ciertas propiedades, incluidos procedimientos quirúrgicos relativamente simples con baja mortalidad, un tamaño y ubicación del infarto consistentes, precipitación de coágulos sanguíneos entremezclados plaquetas:fibrina similares a los de los pacientes y una sensibilidad adecuada al tratamiento fibrinolítico. El modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico basado en colorante de rosa de bengala (RB) cumple con los dos primeros requisitos, pero es altamente refractario al tratamiento lítico mediado por tPA, presumiblemente debido a su composición de coágulos rica en plaquetas, pero pobre en fibrina. Razonamos que la combinación de colorante RB (50 mg/kg) y una dosis subtrombótica de trombina (80 U/kg) para la fotoactivación dirigida a la rama proximal de la arteria cerebral media (ACM) puede producir coágulos enriquecidos en fibrina y sensibles al tPA. De hecho, el modelo de fototrombosis combinada de trombina y RB (T+RB) desencadenó coágulos sanguíneos mixtos de plaquetas:fibrina, como lo demuestran las inmunotinciones y las inmunomanchas, y mantuvo tamaños y ubicaciones de infarto consistentes, además de una baja mortalidad. Además, la inyección intravenosa de tPA (alteplasa, 10 mg/kg) dentro de las 2 h posteriores a la fotoactivación disminuyó significativamente el tamaño del infarto en la fototrombosis T+RB. Por lo tanto, el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico mejorado con trombina puede ser un modelo experimental útil para probar nuevas terapias trombolíticas.

Introduction

La trombectomía endovascular y la trombólisis mediada por tPA son las únicas dos terapias aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para el accidente cerebrovascular isquémico agudo, que afecta a ~ 700,000 pacientes anualmente enlos Estados Unidos. Debido a que la aplicación de la trombectomía se limita a la oclusión de vasos grandes (LVO), mientras que la trombólisis tPA puede aliviar las oclusiones de vasos pequeños, ambas son terapias valiosas para el accidente cerebrovascular isquémico agudo2. Además, la combinación de ambas terapias (p. ej., inicio de la tPA-trombólisis dentro de las 4,5 horas posteriores al inicio del ictus, seguida de trombectomía) mejora la reperfusión y los resultados funcionales3. Por lo tanto, la optimización de la trombólisis sigue siendo un objetivo importante para la investigación del ictus, incluso en la era de la trombectomía.

Los modelos tromboembólicos son una herramienta esencial para la investigación preclínica del ictus con el objetivo de mejorar las terapias trombolíticas. Esto se debe a que los modelos de oclusión vascular mecánica (p. ej., oclusión de ACM con sutura intraluminal) no producen coágulos sanguíneos, y su rápida recuperación del flujo sanguíneo cerebral después de la eliminación de la oclusión mecánica está excesivamente idealizada 4,5. Hasta la fecha, los principales modelos tromboembólicos incluyen fototrombosis 6,7,8, aplicación tópica de cloruro férrico (FeCl3)9, microinyección de trombina en la rama MCA 10,11, inyección de (micro)émbolos ex vivo en la ACM o arteria carótida común (CCA)12,13,14 e hipoxia-isquemia transitoria (tHI)15,16, 17,18. Estos modelos de accidente cerebrovascular difieren en la composición histológica de los coágulos subsiguientes y en la sensibilidad a las terapias líticas mediadas por tPA (Tabla 1). También varían en el requerimiento quirúrgico de la craneotomía (necesaria para la inyección de trombina in situ y la aplicación tópica de FeCl3), la consistencia del tamaño y la ubicación del infarto (p. ej., la infusión de microémbolos con CCA produce resultados muy variables) y los efectos globales sobre el sistema cardiovascular (p. ej., la tHI aumenta la frecuencia cardíaca y el gasto cardíaco para compensar la vasodilatación periférica inducida por hipoxia).

El modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico (PTS) basado en colorante RB tiene muchas características atractivas, incluidos procedimientos quirúrgicos simples sin craneotomía, baja mortalidad (generalmente < 5%) y un tamaño y ubicación predecibles del infarto (en el territorio proveedor de MCA), pero tiene dos limitaciones principales. 8 La primera advertencia es la respuesta débil o nula al tratamiento trombolítico mediado por tPA, que también es un inconveniente del modelo FeCl3 7,19,20. La segunda advertencia de los modelos de accidente cerebrovascular PTS y FeCl3 es que los trombos resultantes consisten en agregados plaquetarios densamente empaquetados con una pequeña cantidad de fibrina, lo que no solo conduce a su resistencia a la terapia tPA-lítica, sino que también se desvía del patrón de trombos de plaquetas:fibrina entremezclados en pacientes con accidente cerebrovascular isquémico agudo21,22. Por el contrario, el modelo de microinyección de trombina in situ comprende principalmente fibrina polimerizada y un contenido incierto de plaquetas10.

Teniendo en cuenta el razonamiento anterior, planteamos la hipótesis de que la mezcla de RB y una dosis subtrombótica de trombina para la fotoactivación dirigida a MCA a través del cráneo adelgazado puede aumentar el componente de fibrina en los trombos resultantes y aumentar la sensibilidad al tratamiento lítico mediado por tPA. Hemos confirmado esta hipótesis23 y en este trabajo describimos en detalle los procedimientos del modelo de ictus fototrombótico modificado (T+RB).

Protocol

Este protocolo está aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) de la Universidad de Virginia y sigue las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. En la Figura 1A se describe la secuencia de procedimientos quirúrgicos de este protocolo. 1. Configuración de la cirugía Coloque una almohadilla térmica con temperatura a 37 °C en el adaptador …

Representative Results

En primer lugar, comparamos el contenido de fibrina en RB frente a los coágulos sanguíneos inducidos por fototrombosis T+RB. Los ratones fueron sacrificados por perfusión transcardial de fijadores a las 2 h después de la fotoactivación, y los cerebros fueron extraídos para la tinción por inmunofluorescencia de la rama MCA en planos longitudinales y transversales. En la fototrombosis RB, la rama de la ACM estaba densamente repleta de plaquetas CD41+ y poca fibrina (Figura 2<…

Discussion

El accidente cerebrovascular fototrombótico RB tradicional, introducido en 1985, es un modelo atractivo de isquemia cerebral focal para procedimientos quirúrgicos simples, baja mortalidad y alta reproducibilidad del infarto cerebral. 5 En este modelo, el colorante fotodinámico RB activa rápidamente las plaquetas al excitarse con la luz, lo que da lugar a agregados densos que ocluyen el vaso sanguíneo 5,8,23.<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH (NS108763, NS100419, NS095064 y HD080429 a C.Y.K.; y NS106592 a Y.Y.S.).

Materials

2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma T8877 infarct
4-0 Nylon monofilament suture LOOK 766B surgical supplies
5-0 silk suture Harvard Apparatus 624143 surgical supplies
543nm laser beam Melles Griot 25-LGP-193-249 photothrombosis
adult male mice Charles River C57BL/6 10~14 weeks old (22~30 g)
Anesthesia bar for mouse adaptor machine shop, UVA surgical setup
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) Sigma T48402 euthanasia
Dental drill Dentamerica Rotex 782 surgical setup
Digital microscope Dino-Lite AM2111 brain imaging
Dissecting microscope Olympus SZ40 surgical setup
Fine curved forceps (serrated) FST 11370-31 surgical instrument
Fine curved forceps (smooth) FST 11373-12 surgical instrument
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 Invitrogen A11008 Immunohistochemistry
Halsted-Mosquito hemostats FST 13008-12 surgical instrument
Heat pump with warming pad Gaymar TP700 surgical setup
infusion pump KD Scientific 200 thrombolytic treatment
Insulin syringe with 31G needle BD 328291 photothrombosis
Ketamine CCM, UVA anesthesia
Laser protective google 532nm Thorlabs LG3 photothrombosis
Meloxicam SR CCM, UVA NSAID analgesia
micro needle holders FST 12060-01 surgical instrument
micro scissors FST 15000-03 surgical instrument
MoorFLPI-2 blood flow imager Moor 780-nm laser source Laser Speckle Contrast Imaging
Mouse adaptor RWD 68014 surgical setup
Puralube Vet ointment Fisher NC0138063 eye dryness prevention
Retractor tips Kent Scientific Surgi-5014-2 surgical setup
Rose Bengal Sigma 198250 photothrombosis
Thrombin Sigma T7513 photothrombosis
Tissue glue Abbott Laboratories NC9855218 surgical supplies
tPA Genetech Cathflo activase 2mg thrombolytic treatment
Vibratome Stoelting 51425 TTC infacrt
Xylazine CCM, UVA anesthesia

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Cite This Article
Kuo, Y., Sun, Y., Kuan, C. A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model. J. Vis. Exp. (172), e61740, doi:10.3791/61740 (2021).

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