En fibrinberikad och tPA-känslig fototrombotisk strokemodell
Summary
Traditionella modeller för fototrombotisk stroke (PTS) inducerar huvudsakligen täta trombocytaggregat med hög resistens mot vävnadsplasminogenaktivator (tPA)-lytisk behandling. Här introduceras en modifierad murin PTS-modell genom saminjektion av trombin och ljuskänsligt färgämne för fotoaktivering. Den trombinförstärkta PTS-modellen ger blandade blodplättar-fibrin-koaguler och är mycket känslig för tPA-trombolys.
Abstract
En idealisk tromboembolisk strokemodell kräver vissa egenskaper, inklusive relativt enkla kirurgiska ingrepp med låg mortalitet, en konsekvent infarktstorlek och infallsplats, utfällning av blodplättar-fibrin-blandade blodproppar liknande dem hos patienter och en adekvat känslighet för fibrinolytisk behandling. Den färgämnesbaserade fototrombotiska strokemodellen uppfyller de två första kraven men är mycket resistent mot tPA-medierad lytisk behandling, förmodligen på grund av dess blodplättsrika, men fibrinfattiga koagelsammansättning. Vi resonerar att kombinationen av RB-färgämne (50 mg/kg) och en subtrombotisk dos av trombin (80 E/kg) för fotoaktivering riktad mot den proximala grenen av mellersta hjärnartären (MCA) kan ge fibrinberikade och tPA-känsliga blodproppar. Faktum är att den trombin- och RB (T+RB)-kombinerade fototrombosmodellen utlöste blandade blodplättar-fibrinblodproppar, vilket visades genom immunfärgning och immunbloter, och bibehöll konsekventa infarktstorlekar och platser plus låg dödlighet. Dessutom minskade intravenös injektion av tPA (Alteplas, 10 mg/kg) inom 2 timmar efter fotoaktivering signifikant infarktstorleken vid T+RB-fototrombos. Således kan den trombinförstärkta fototrombotiska strokemodellen vara en användbar experimentell modell för att testa nya trombolytiska terapier.
Introduction
Endovaskulär trombektomi och tPA-medierad trombolys är de enda två behandlingar av akut ischemisk stroke som godkänts av U.S. Food and Drug Administration (FDA) och som drabbar ~700 000 patienter årligeni USA. Eftersom tillämpningen av trombektomi är begränsad till ocklusion av stora kärl (LVO), medan tPA-trombolys kan lindra ocklusioner av små kärl, är båda värdefulla terapier av akut ischemisk stroke2. Dessutom förbättrar kombinationen av båda behandlingarna (t.ex. initiering av tPA-trombolys inom 4,5 timmar efter strokedebut, följt av trombektomi) reperfusionen och de funktionella resultaten3. Att optimera trombolys är därför fortfarande ett viktigt mål för strokeforskningen, även i trombektomins tidevarv.
Tromboemboliska modeller är ett viktigt verktyg för preklinisk strokeforskning som syftar till att förbättra trombolytiska behandlingar. Detta beror på att mekaniska vaskulära ocklusionsmodeller (t.ex. intraluminal sutur MCA-ocklusion) inte ger blodproppar, och dess snabba återhämtning av cerebralt blodflöde efter avlägsnande av mekanisk ocklusion är alltför idealiserad 4,5. Hittills inkluderar de viktigaste tromboembolimodellerna fototrombos 6,7,8, topikal järnklorid (FeCl3) applicering 9, mikroinjektion av trombin i MCA-grenen 10,11, injektion av ex vivo (mikro)emboli i MCA eller gemensam halspulsåder (CCA)12,13,14 och övergående hypoxi-ischemi (tHI)15,16, 17,18. Dessa strokemodeller skiljer sig åt i den histologiska sammansättningen av efterföljande blodproppar och känsligheten för tPA-medierad lytisk terapi (tabell 1). De varierar också i det kirurgiska behovet av kraniotomi (som behövs för trombininjektion in situ och topikal applicering av FeCl3), konsistensen av infarktens storlek och läge (t.ex. CCA-infusion av mikroemboli ger mycket varierande resultat) och globala effekter på det kardiovaskulära systemet (t.ex. tHI ökar hjärtfrekvensen och hjärtminutvolymen för att kompensera för hypoxi-inducerad perifer vasodilatation).
Den RB-färgbaserade fototrombotiska strokemodellen (PTS) har många attraktiva egenskaper, inklusive enkla kraniotomifria kirurgiska ingrepp, låg dödlighet (vanligtvis < 5 %) och en förutsägbar storlek och plats för infarkt (i MCA-försörjningsområdet), men den har två stora begränsningar. 8 Den första invändningen är svagt till noll svar på tPA-medierad trombolysbehandling, vilket också är en nackdel med FeCl3 modell 7,19,20. Den andra invändningen mot PTS- och FeCl 3-taktsmodeller är att de efterföljande tromberna består av tätt packade trombocytaggregat med en liten mängd fibrin, vilket inte bara leder till dess motståndskraft mot tPA-lytisk behandling, utan också avviker från mönstret av blandade trombocyter:fibrintrombi hos patienter med akut ischemisk stroke21,22. Däremot består in situ trombin-mikroinjektionsmodellen huvudsakligen av polymeriserat fibrin och ett osäkert innehåll av trombocyter10.
Givet ovanstående resonemang antog vi att blandning av RB och en subtrombotisk dos av trombin för MCA-riktad fotoaktivering genom förtunnad skalle kan öka fibrinkomponenten i den resulterande trombin och öka känsligheten för tPA-medierad lytisk behandling. Vi har bekräftat denna hypotes,23 och här beskriver vi detaljerade procedurer för den modifierade (T+RB) fototrombotiska strokemodellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den traditionella RB-fototrombotiska stroken, som introducerades 1985, är en attraktiv modell för fokal cerebral ischemi för enkla kirurgiska ingrepp, låg dödlighet och hög reproducerbarhet av hjärninfarkt. 5 I denna modell aktiverar det fotodynamiska färgämnet RB snabbt blodplättar vid ljusexcitation, vilket leder till täta aggregat som täpper till blodkärlet 5,8,23. Den lilla mängden fibri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH-anslagen (NS108763, NS100419, NS095064 och HD080429 till C.Y.K.; och NS106592 till Y.Y.S.).
Materials
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Meloxicam SR | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. . Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
