Summary
이 프로토콜은 Caco2 결장 아데노암종 세포에서 3차원 스페로이드를 생성하고 성장시키는 새로운 견고하고 재현 가능한 배양 시스템을 제공합니다. 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 암 줄기 세포 생물학을 공부하는 이 접근의 적합성을 위한 개념증명을 제공합니다.
Abstract
대장암은 종양 발달, 유지 보수 및 약물에 대한 내성을 담당하는 암 줄기세포(CSC)의 인구를 포함하는 이질성 및 계층적 조직을 특징으로 한다. 그들의 특정 표적을 위한 CSC 속성의 더 나은 이해는, 그러므로, 효과적인 치료를 위한 전제 조건입니다. 그러나 심층 조사에 적합한 전임상 모델이 부족합니다. 시험관 내 2차원 (2D) 암 세포주가 종양 생물학에 귀중한 통찰력을 제공하지만, 그들은 현상및 유전 종양 이질성을 복제하지 않습니다. 대조적으로, 3차원 (3D) 모형은 거의 생리적인 암 복잡성 및 세포 이질성을 해결하고 재현합니다. 이 작업의 목적은 CSC 생물학을 연구하기 위해 강력하고 재현 가능한 3D 문화 시스템을 설계하는 것이었습니다. 본 방법론은 장기 배양에 사용될 수 있는 모델인 Caco2 결장 아데노암종 세포로부터 동질적인 3D 스페로이드를 생성하는 조건의 개발 및 최적화를 설명합니다. 중요한 것은, 스페로이드 내에서, 루멘과 같은 구조물을 중심으로 조직된 세포는, 차동 세포 증식 패턴및 마커 패널을 표현하는 CSC의 존재에 의해 특징지어졌다. 이러한 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 세포 이질성 및 CSC 생물학을 연구하기 위한 이 3D 접근법의 적합성을 위한 첫 번째 개념 증명을 제공합니다.
Introduction
대장암(CRC)은 세계1에서암 관련 사망의 두 번째 주요 원인으로 남아 있다. CRC의 발달은 종양 억제 유전자3,4의온코진 활성화 및 불활성화를 포함하는 유전 돌연변이 및/또는 후성유전학 적 변경2,3의점진적 습득 및 축적의 결과입니다. 더욱이, 비유전적 요인(예를 들어, 마이크로환경)은 종양성 변혁에 기여하고 촉진하여 CRC5의진화에 참여할 수 있다. 중요한 것은, CRC는 정상 결장 토굴6,7에서상피의 조직을 연상시키는 계층 구조를 구성하는 일부 분화 된 CSC 및 벌크 종양 세포를 포함한 상이한 세포 집단으로 구성된다.
CSC는 종양 출현8,유지 보수 및 성장, 전이성 용량 및 종래의 치료법에 대한 내성을 담당하는 것으로 간주됩니다6,7. 종양 내에서, CSC를 포함한 암세포는 그들의 명백한 돌연변이 및 후성 유전학 단면도, 형태학 및 표현성 다름, 유전자 발현, 물질 대사, 증식 비율 및 전이성 전위9의관점에서 이질성과 복잡성의 높은 수준을 표시합니다. 따라서, 암 생물학, 종양 진행, 효과적인 치료법으로의 내성 획득, 이 암 이질성 및 계층 구조를 포착하는 인간 전임상 모델은10,11에중요하다.
체외 2D 암 세포주에서 는 오랫동안 사용되어 왔으며 종양 발달과 치료 분자의 효능의 근간이 되는 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 그러나, 본래 종양에서 발견되는 현상및 유전적 이질성의 부족에 대하여 그들의 한계는 지금 널리 인식된다12. 더욱이, 영양분, 산소, pH 그라데이션 및 종양 미세환경은 재현되지 않으며, 마이크로환경은CSC(11,12)를포함한 상이한 세포 유형의 유지에 특히 중요하다. 이러한 주요 단점을 극복하기 위해 여러 3D 모델이 실험적으로 암의 복잡성과 이질성을 해결하고 재현하기 위해 개발되었습니다. 실제로, 이들 모델은 생체 내12,13,14에서관찰된 것과 유사한 종양 세포 이질성, 세포 세포 상호 작용 및 공간아키텍처를재구성한다. 신선한 종양뿐만 아니라 세포 주 유래 스페로이드에서 확립된 1차 종양 오르가노이드는 주로15,16으로채용된다.
스페로이드는 세포가 세포 응집체에서 형성되고 성장하도록 강제하기 위해 비계가 없거나 스캐폴드 기반 방식으로 배양될 수 있다. 스캐폴드 프리 방법은 비부착 조건(예를 들어, 매달려 드롭 방법 또는 초저부착 플레이트)의 세포 배양에 기초한 반면, 스캐폴드 기반 모델은 천연, 합성 또는 하이브리드 생체 재료에 의존하여배양세포(12,13,14)에의존한다. 스캐폴드 계 스페로이드는 최종 스페로이드 형성이 사용되는 (바이오) 물질의 성질과 조성에 따라 달라지기 때문에 상이한 단점을 제시한다. 지금까지 사용할 수있는 스캐폴드프리 스페로이드 방법은 기판의 특성에 의존하지 않지만 구조및 크기17,18에따라 달라지는 스페로이드를 생성한다.
이 연구는 CSC 생물학을 공부하기 위하여 Caco2 결장 선암 세포로 구성된 크기에서 균질한 spheroids의 견고하고 재현가능한 3D 배양 시스템을 설계하는 것을 목표로 했습니다. Caco2 세포는 시간이 지남에 따라 분화 하는 그들의 능력에 때문에 특히 관심19,20,강하게 줄기 같은 잠재력을 제안. 이에 따라, 스페로이드의 장기 문화는 화학요법에 다른 반응을 가진 다른 CSC 인구의 존재를 밝혔습니다.
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Protocol
참고: 모든 시약 및 재료의 세부 정보는 재료 표에나열됩니다.
1. 스페로이드 형성
- 스페로이드 문화 미디어
- 덜벡코의 수정독수리 매체(DMEM)로 구성된 기저형 매체를 4m L-alanyl-L-글루타민 디펩티드로 보충한다.
- 1.1.1단계에서 기저 배지에서 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen/Strep)을 함유한 DMEM 완전 배지를 준비한다.
- 지하 멤브레인 매트릭스 2.5%, FBS 10%, 기초 매체 1%를 포함하는 DMEM/지하 막 매트릭스 배지를 1.1.1단계에서 준비한다.
- 스페로이드 형성을 위한 플레이트 준비
- 실온(RT)에서 약 20분 동안 따뜻한 기저및 DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지.
- 각 우물에 500μL의 안티 준수 헹구는 용액을 추가하여 스페로이드 형성에 전념하는 24웰 플레이트의 우물을 후퇴시킵니다.
참고: 이 플레이트에서는 각 음웰이 1,200마이크로웰로 구성됩니다. - 플레이트용 어댑터가 있는 스윙 버킷 로터에서 1,200× g의 플레이트원심분리기.
참고: 한 접시만 사용하는 경우 무게의 균형을 맞추기 위해 물로 채워진 표준 플레이트를 추가로 준비합니다. - 따뜻한 기저 질의 2mL로 각각 잘 헹구고 우물에서 배지를 흡인시합니다.
- 현미경의 밑에 접시를 관찰하여 기포가 마이크로웰에서 완전히 제거되었는지 확인합니다. 거품이 갇혀 있는 경우, 원심분리기는 거품을 제거하기 위해 5 분 동안 1,200 × g에서 다시 원심분리기를 제거합니다.
- 헹도 단계를 반복합니다 1.2.4-1.2.5.
- 각 웰에 따뜻한 DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지 1mL를 추가합니다.
- 스페로이드 생성
- 5% CO2를 포함하는 가습된 분위기에서 10% FBS 및 1% 펜/스트렙으로 보충된 DMEM 배지내의 2D 단층에서 Caco2 세포를 성장시다(이하 37°C/5%CO2라고 함).
참고: 사용할 최대 셀 구절 수는 80개입니다. - 인플루언서의 80%에 도달하면 인산완충식살린(PBS) 1x(10cm 접시에 5mL)로 세포를 씻고, 트립신 에틸렌디아민 테트라아세산(EDTA)(10cm 접시2mL)을 추가하고, 37°C에서 2~5분 동안인큐베이트에 2-5%를 더한다.
- 현미경으로 세포 분리를 확인하고, 10cm 접시 당 DMEM 의 4 mL을 추가하여 트립신을 중화시다.
- 혈종계를 사용하여 세포를 계산하여 총 세포 수를 결정합니다.
- 세포 현탁액을 1,200 × g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상체를 버리고, DMEM/지하 막 매트릭스 배지의 적절한 부피로 펠릿을 재놓는다.
- 마이크로웰 당 원하는 수의 세포수를 달성하기 위해 웰당 필요한 세포 수를 결정하기 위해 표 1을 참조하십시오. 또는, 24웰 플레이트에 대해 다음 수식을 사용하여 세포 수를 계산하고, 각 우물에는 1,200마이크로웰이 포함되어 있습니다.
웰 당 필요한 세포 수 = 마이크로웰 당 원하는 세포 수 × 1,200 - 1 mL의 최종 부피에서 원하는 세포 수를 달성하기 위해 각 웰에 셀 서스펜션의 필요한 부피를 추가합니다.
- DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지 1mL을 각 웰에 추가하여 웰당 2mL의 최종 부피에 도달합니다(1.2.7단계 참조).
참고 : 마이크로 웰에 거품을 소개하지 않도록주의하십시오. - 소웰에서 세포를 포획하기 위해 5 분 동안 1,200 × g에서 즉시 플레이트를 원심 분리합니다. 필요한 경우 원심분리기를 물로 채워진 표준 플레이트와 균형을 맞설 수 있습니다.
- 현미경의 밑에 플레이트를 관찰하여 세포가 마이크로웰 사이에서 균등하게 분포되어 있는지 확인합니다.
- 플레이트를 방해하지 않고 48h에 대해 37°C/5%CO2에서 플레이트를 배양합니다.
참고 : 원래 프로토콜(21)에따르면 많은 세포주가 24 시간 이내에 스페로이드를 형성 할 수 있지만 일부는 더 긴 잠복기가 필요합니다. 이 프로토콜에서 48h는 스페로이드 형성에 충분합니다.
- 5% CO2를 포함하는 가습된 분위기에서 10% FBS 및 1% 펜/스트렙으로 보충된 DMEM 배지내의 2D 단층에서 Caco2 세포를 성장시다(이하 37°C/5%CO2라고 함).
- 마이크로웰에서 스페로이드 수확
- RT에서 기저 및 DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지를 약 20분 동안 데워보시킵니다.
- 세로지학적 파이펫을 사용하여 각 우물에서 배양 배지(1mL)의 절반을 제거합니다.
- 마이크로웰에서 스페로이드를 제거하기 위해 배지를 우물 표면에 다시 넣습니다.
참고: 스페로이드를 만지거나 삼중시키지 마십시오. - 15mL 원피스 튜브 상단에 37 μm 가역 스트레이너(또는 40μm 표준 스트레이너)를 배치하여 스페로이드를 수집합니다.
참고: 40 μm 표준 여과기를 사용하는 경우 거꾸로 놓습니다. - 제거된 스페로이드(1.4.3단계에서)를 부드럽게 흡인시키고 스페로이드 서스펜션을 여과기를 통과합니다.
참고: 스페로이드는 필터에 유지됩니다. 단일 셀은 배지로 흐르게 됩니다. - 세로지학적 파이펫을 사용하여 웰의 전체 표면에 따뜻한 기저 배지 1mL을 분배하여 남은 스페로이드를 빼내고 여조기에 회수합니다.
- 이 세탁 단계를 두 번 반복하십시오.
- 현미경 의 밑에 접시를 관찰하여 모든 스페로이드가 마이크로웰에서 제거되었는지 확인합니다. 필요한 경우 세척을 반복하십시오(1.4.6-1.4.7 단계).
- 여과기를 반전시키고 새로운 15mL 원추형 튜브에 놓습니다. DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지로 스트레이너를 세척하여 스페로이드를 수집합니다.
참고: 수집된 스페로이드는 다운스트림 응용 프로그램 및 분석을 위해 준비되었습니다.
- 스페로이드의 장기 문화
- 기저 배지에 1.5% 아가로즈 용액을 준비하고, 오토클레이브(표준 사이클)를 통해 멸균한다.
- 아가로즈 용액은 따뜻하고 여전히 액체이지만 표 2에설명된 바와 같이 표준 배양 접시 또는 접시의 우물을 코팅합니다.
참고 : 오븐에서 접시 / 접시를 따뜻하게하면 코팅 단계를 용이하게합니다. 코팅 된 접시 / 접시는 멸균 환경에서 최대 10 일 동안 RT에 남아 빛으로부터 보호 할 수 있습니다. - 아가로즈 코팅 플레이트에서 수확된 스페로이드(1.4.9단계에서)를 시드하고, DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지를 추가하여 플레이트의 크기에 따라 최종 부피를 달성한다.
참고: 스페로이드 응집체를 피하려면 22스페로이드/cm2의최적 밀도로 시드하십시오. 코팅이 완벽하게 평평하지 않고 가장자리쪽으로 상승하여 플레이트 중앙에 가벼운 굴착을 일으킵니다. 스페로이드의 수가 너무 높으면 서로 고칠 가능성이 높습니다. - 특정 분석을 위해 스페로이드를 회수할 때까지 플레이트를 37°C/5%CO2로 배양한다.
- 화학 요법 약물로 스페로이드 치료
- 플레이트 스페로이드는 1.5.4 단계에서 2 일 동안 성장합니다. 3일째 (D3)부터 시작하여 FOLFIRI(5-플루오로라실, 50 μg/mL)로 치료하십시오. 이리노테칸, 100 μg/mL; 류코보린, 25 μg/mL) 또는 FOLFOX(5-플루오루라실, 50 μg/mL; 옥산스립라틴, 10 μg/mL; 류코보린, 25 μg/mL) 화학요법 요법 조합은 CRC 환자를 치료하기 위해 일상적으로 사용된다22,23,24,25,또는 (대조) 치료되지 않은 (NT) 조건에서 유지.
- 팁 이 끊기(1,000 μL 팁)가 있는 파이펫을 사용하여 처리 3일 후에 스페로이드를 수집하여 각 조건이 적어도 3개의 복제로 표현되도록 합니다. 원심 분리는 3 분 동안 1,000 × g로 한 다음 상체를 제거합니다.
- 조직학적 분석을 위해 2% 파라포름알데히드(PFA)로 펠릿을 고정하거나 RNA 추출을 위해 펠릿을 사용한다(섹션 4 참조).
- 세포사멸을 분석하기 위해, DMEM/지하막 매트릭스 배지에서 흑배양웰 플레이트에서 1.6.1단계로부터 스페로이드를 30분 동안 배양하여 살아있는 세포에 침투하지 않는 핵산 얼룩(1:5000 희석)을 가지고, 그러나 죽은 세포의 손상된막(26)을관통한다. 마이크로 플레이트 판독기와 형광의 축적을 측정합니다.
2. 스페로이드 성장 모니터링
- 반전 된 현미경을 사용하여, 문화에서 일 내내 다른 조건하에서 유지 되는 스페로이드의 대표적인 이미지를 취득.
- 적절한 소프트웨어를 사용하여 각 스페로이드의 3가지 대표 직경을 측정하여 이미지를 분석합니다.
- 다음 수식을 사용하여 예상 구 체적을 가져옵니다.
참고: 용어, d1, d2 및 d3는 스페로이드의 세 가지 직경입니다.
3. 면역 형광 (IF) 및 조직학적 염색
- 고정 및 파라핀 포함
- 1.6.2 단계에서 설명한 바와 같이 팁이 잘린 파이펫을 사용하여 선택한 시간 지점에서 스페로이드를 수집하고 2% PFA에서 RT에서 30분 동안 수정합니다.
참고: 또는 추가 사용이 될 때까지 이 단계에서 샘플을 4°C로 저장합니다. - 파라핀 포함의 경우 PBS 1x로 스페로이드 3배를 세척하고 70% 에탄올로 재보선다. 파라핀 포함 및 단면 후 조직학적 분석을 위해 헤마톡시린 및 에오신(H&E) 염색을 수행합니다.
- 1.6.2 단계에서 설명한 바와 같이 팁이 잘린 파이펫을 사용하여 선택한 시간 지점에서 스페로이드를 수집하고 2% PFA에서 RT에서 30분 동안 수정합니다.
- 파라핀 섹션의 면역 라벨링
참고: 간접 면역 염색을 위해 5μm 두께의 섹션을 사용합니다.- 왁스를 녹이고 분리화를 개선하기 위해 2 시간 동안 60 °C에서 슬라이드를 인큐베이션합니다.
- 메틸시클로헥산에서 슬라이드를 3분 동안 두 번 씻으십시오.
- 슬라이드를 1:1 메틸시클로헥산:100% 에탄올로 3분 간 세척합니다.
- 슬라이드를 100% 에탄올로 3분 동안 두 번 씻으십시오.
참고: 3.2.2 단계의 모든 조작을 수행하여 화학 후드에서 3.2.4 단계를 수행합니다. - 슬라이드를 90% 에탄올로 3분 동안 씻으십시오.
- 75%의 에탄올로 슬라이드를 3분 동안 세척합니다.
- 50% 에탄올로 슬라이드를 3분 동안 씻으십시오.
- 수돗물 아래에서 슬라이드를 씻으십시오.
- 5 분 동안 증류수에 슬라이드를 다시 수분.
- 0.01 M 구연산 버퍼, pH 6.0의 700 mL을 준비하고 적합한 용기에 추가하십시오 (너비 : 11.5 cm, 길이 : 17cm, 높이 : 7cm); 슬라이드를 잠급합니다. 전자레인지에 있는 용기를 700W에서 9-10분 동안 가열하고 끓이기 시작하면 400-450W. 인큐베이터의 전력을 추가로 10분 간 감소시다.
- 약 30-40분 동안 버퍼에서 슬라이드를 RT로 식힙니다.
- 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 두 번 씻으십시오.
- 마커 펜으로 섹션 주위에 원을 그리면 섹션에 적용된 액체에 대한 장벽을 만듭니다.
- 각 섹션에 50 μL의 블로킹 버퍼(일반 염소 세럼 10%, 소 세럼 알부민 1%, PBS의 0.02% Triton X-100)를 RT에서 최소 30분 동안 배양합니다.
- 차단 버퍼를 제거하고 인큐베이션 버퍼에서 희석된 1차 항체의 50 μL을 추가합니다(일반 염소 혈청 1%, BSA 0.1%, PBS에서 0.02% 트리톤 X-100). RT에서 2 시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 1 차적인 항체를 제거하고 PBS에서 슬라이드3x를 5 분 동안 세척하십시오.
- RT에서 1h에 대한 인큐베이션 버퍼에서 희석된 형광 이차 항체의 50 μL로 슬라이드를 배양한다.
- 이차 항체를 제거하고 PBS에서 슬라이드를 3x로 5 분 동안 세척하십시오.
- 각 섹션에 4′,6-diamidino-2-phenylindole와 장착 매체의 50 μL을 추가하고, 섹션 위에 유리 커버 슬립을 배치합니다.
4. RNA 추출, 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR), 및 정량성 RT-PCR(qRT-PCR)
- 다른 시간 지점에서 스페로이드를 수집, 각 점은 적어도 세 복제로 표현. 원심 분리는 3 분 동안 1,000 × g로 한 다음 상체를 제거합니다.
참고: 펠릿은 RNA 추출에 직접 사용하거나 추가 사용이 있을 때까지 -20°C에 저장될 수 있습니다. - 제조 업체의 지침에 따라 상용 RNA 격리 키트를 사용하여 총 RNA를 분리합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 각 RNA 샘플의 500 ng를 보완 DNA (cDNA)로 역 전사합니다.
- 역전사 후, 다른 엑슨에 있는 프라이머로 가사 유전자를 증폭시키기 위해 cDNA의 1 μL에 PCR 분석을 수행합니다.
참고: 이 단계는 RNA 제제에 있는 어떤 유전체 DNA 오염의 부재의 확인을 가능하게 합니다. 이 프로토콜을 위해 펩디딜프로릴 이솜라제B(PPIB) 프라이머가 사용되었다. - 관심 유전자에 특정 프라이머를 사용하여 이전에 희석 된 cDNA (RNAse 프리 이중 증류수에서 1:10)의 4 μL에 qPCR 증폭을 수행합니다. 각 샘플에서, ΔΔCt 방법을 사용하여 특정 mRNA 발현을 정량화하고 가사 유전자 수준에 대해 정규화된 값을 한다.
참고: 이 프로토콜의 경우 β액틴(ACTB)이 선택되었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 프라이머는 표 3에나열됩니다.
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Representative Results
스페로이드의 크기에서 균질성의 부재가 현재 사용 가능한 3D 스페로이드 배양시스템(13)의주요 단점 중 하나이기 때문에, 이 작업의 목적은 균일한 스페로이드를 얻기 위해 신뢰할 수 있고 재현 가능한 프로토콜을 설정하는 것이었습니다. 첫째, 이상적인 작업 조건을 확립하기 위해, 전용 플레이트(표 1)를 사용하여 마이크로웰/스페로이드당 50~2,000세포에 이르는 Caco2 세포의 상이한수(표 1)를시험하였다. 실제로, 이들 플레이트의 각 우물에는 1,200마이크로웰이 들어있어, 웰당 동일한 수의 스페로이드를 형성할 수 있으며, 더 중요한 것은마이크로웰(21)당하나의 스페로이드의 형성이다. 배양 이틀 후, 스페로이드 당 2,000세포를 함유하는 우물은 단층으로 성장했으며, 스페로이드당 50개의 세포가 작고 비균일한 스페로이드(도1A)를발생시켰습니다. 따라서 이러한 두 가지 조건은 추가 분석에서 제외되었습니다. 장기 문화를 확립하기 위해 스페로이드는 마이크로웰에서 수확하고 갓 준비된 아가로즈 코팅 플레이트에서 비 부착 된 조건에서 시드되었습니다. 스페로이드 성장은 그 때 부피의 변화를 측정하여 실험 시간 과정 전반에 걸쳐 감시되었다. 비구형 형상을 고려하기 위해 각 구형의 3개의 서로 다른 직경을 측정하고, 부피 포뮬러가27(도 1B)를적용하였다. 100 및 200 세포에서 생성된 스페로이드는 실험 의 전체 과정을 통해 초기 크기를 유지한 반면, 1,000개의 세포를 함유한 세포는 큰 크기로 인해 수확 하는 동안 분해되어 결과적으로 부피의 변동성이 더 커졌습니다. 따라서 500세포로부터 발생하는 스페로이드가 실험 시간 과정 동안 크기가 가장 균일하게 증가하는 것으로 나타났기 때문에, 이 수의 세포가 스페로이드 형성에 사용되었다.
둘째, 스페로이드 당 500 세포 외에, 300에서 800 세포에 이르기까지 추가 세포 수를 공부하였다. 더욱이, 비준수 조건을 개선하기 위해, 원래 의정서는 하나의 세척만 을 적용하는 대신 우물을 두 번 전처리하여 수정되었다. 이러한 변화와 함께 스페로이드 균질성 및 다짐의 개선이 관찰되었다(도2A). 각 조건에서 스페로이드의 크기는 수확시(도2B)에측정되었고, 그들의 장기 성장은 아가로즈 코팅 된 요리(도 2C)에서문화에서 일 내내 모니터링되었다. 결과에 기초하여, 500 및 600 세포/스페로이드는 양호한 성장과 낮은 가변성을 산출하는 최적 조건으로 확인되었다. 실험 시간 과정 및 형성된 소형 구조 전반에 걸쳐 보다 균일한 성장 프로파일로 인해, 스페로이드 당 600개의 세포가 후속 실험을 위한 세포 수로 선택되었다. 마지막으로, 프로토콜을 더욱 개선하기 위해 DMEM 완전 배지는 지하 막 매트릭스의 2.5%로 보충되었으며, 여기에는 추가 성장 인자와 세포외 매트릭스단백질(28)의대형 패널이 포함되어 있다. 실제로, 스페로이드의 다중 형상은 세포편광(29,30)에영향을 미칠 수 있는 미세 환경으로부터의 신호의 부족으로 인한 것일 수 있다. 지하 막 매트릭스의 첨가는 스페로이드 성장을 향상시키고 균질성을 향상시켰습니다(도2D). 이러한 개선의 예는 스페로이드 당 500개의 세포에 대해 볼 수 있다. 지하 막 매트릭스(도1B)의부재시, 스페로이드의 크기는 D3에서 D7로 두 배로 증가한 후 고원에 도달하면서 더 이질적이었습니다. 그러나, 지하 막 매트릭스(도2C)의존재에서, 각 시간 지점에서 스페로이드의 크기는 시간이 지남에 따라 비례적으로 증가, 더 균일했다.
스페로이드의 장기적인 특징을 분석하기 위해, 그들은 파라핀 섹션에 대한 상세한 조직학 및 IF 분석을 위해 아가로즈 코팅 요리에서 문화 후 다른 시간 지점에서 회수되었다. H&E 염색은 스페로이드 내의 세포가 시간이 지남에 따라 조직과 모양에 변화를 겪고 있음을 보여주었습니다. 실제로, 세포는 D3에서 다층에서 조밀하게 배열되었고, 단층으로 배열된 평평한 세포는 D10에서 명확하게 보였다. 흥미롭게도, 이미지의 검은 점선에 의해 표시된 바와 같이, 루멘은 D5 이후(그림 3)에서스페로이드 내에서 나타났다. 병렬로, 세포 증식 및 세포 세포 증식은 증식 마커를 사용하는 경우, 세포 핵 항원(PCNA) 및 세포사멸 마커, 활성화된 카스파제 3을 사용하여 분석하였다. PCNA에 대한 라벨링은 확산 세포가 종종 구체형의 외부 표면에 존재했다는 것을 밝혔다, 때로는 오간배양15를연상시키는 토굴 같은 또는 싹 같은 구조에. 또한, D5 및 D7에서 PCNA 양성 세포의 명확한 증가는 D10(도4,좌판)에 의해 감소되는 것을 관찰하였다. 놀랍게도, 활성화된 카스파제 3은 D3 와 D5(도4,왼쪽 패널) 및 더 긴 기간(도시되지 않은 데이터)에서 스페로이드에서 극소수의 세포에서 관찰되었다. β 카테닌의 발현 패턴도 파라핀 섹션에서 평가되었다. 흥미롭게도, 명확한 막 바운드 및 세포질 염색(도 4,오른쪽 패널)와 각 시간 지점에서 β-카세닌 발현의 높은 수준을 관찰하였다. 막 바인딩 된 β 카테닌은 E-cadherin(31)에결합하여 세포 부착에 참여하는 것을 주목할 필요가있다. 높은 수준의 ß-카세닌 라벨링은 모든 시간 지점에서 셀 클러스터에서 지적되었습니다. 경우에 따라 세포는 명확한 핵 ß-카세닌국소화(그림 4,오른쪽 패널)를 표시하기도 했다. Caco2 세포는 주로 엔테로세포(19,32)로2D에서 시험관내분화하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 염색체그라닌 A(장내분비 세포), 리소지메(Paneth 세포) 또는 뮤신 2(MUC 2, 잔잔 세포)와 같은 분화 마커의 발현은 IF(데이터가 도시되지 않음)에 의해 이들 스페로이드에서 검출할 수 없었다. 그러나, 장내세포로 분화할 가능성이 확인되었으며, 스페로이드가 ALPI(알칼리성 포스파타제) 및 솔루트 캐리어 패밀리 2, 성적증명서 변이체2(SLC2A5)/포도당수송기5(GLUT5)mRNAs(그림5)를발현한 것을 감안할 때 확인되었다. 이러한 mRNA 수준은 D5 및 D7에서 증가했지만, D3의 수준에 비해 차이가 유의하지않거나(ALPI)또는 약간 유의한(SLC2A5)였다.
이 새로운 방법을 기반으로 생성되고 배양된 스페로이드가 CSC를 연구하는 신뢰할 수 있는 도구인지 를 정의하는 최종 목적으로 CSC 마커의 발현은 IF 및 qRT-PCR에 의해 분석되었습니다. CD133 및 CD44는 CSC7,33,34를 포함한 암 세포 집단을 특징으로 하며 또한 정상 장 및대장(33,34,35)에서SC에 의해 발현된다. CD133 양성 세포의 클러스터는 주로 각 시점에 스페로이드의 외부 표면에 국한되었다(도6A, 좌판). CD44 양성 세포는 덜 빈번했지만 항상 CD133 양성세포(그림 6A, 오른쪽 패널)와 연관되어 CD133/CD44 이중 양성 CSC와 같은 세포의 존재와 CD133만 을 발현하는 집단의 존재를 나타냈습니다. 올티오페딘 4 (OLFM4) 및 무사시 1 (MSI1)은 SC / CSC 마커로 검사되었다; 이들 마커는 결장토굴(36,37)에서 매우 제한된 방식으로 발현되며 또한 뚜렷한 세포집단(35,38)에서발현된다. OLFM4는 검출할 수 없는 반면, 각시점(도 7)에서소수의 MSI1 양성 세포만 관찰되었다(데이터는 도시되지 않음). 그럼에도 불구하고, CD44 및 CD133에 대해 관찰된 바와 같이, MSI1 표지된 세포는 토굴형 또는 싹과 같은 구조에서 스페로이드의 외부 표면에 위치하였다. 동일한 마커는 또한 아가로 코팅 된 접시에서 배양 후 동시에 mRNA 수준에서 분석되었다. 알데히드 탈수소효소 1(ALDH1a1),CSC39,40의잘 특징적인 마커, 또한 연구에 포함되었다(도 8). 프로미닌-1(CD133용PROM1 인코딩) 및 CD44 mRNAs의 분석은 분석된 모든 시간 지점에서 스페로이드에서 두 마커의 발현을 확인하였다. 참고, 그러나, PROM1 mRNA 수준은 문화권에서 시간이 지남에 따라 매우 유사 하는 동안, CD44 수준 이후 D3에서 감소. 그러나 D10 및 D3의 mRNA 수준을 비교할 때 그 차이는 약간 중요했습니다.
MSI1 mRNA의 분석은 D7 또는 D10(도 8)에비해 D3 및 D5에서 상당히 높은 수준으로 각 시점에서 스페로이드에서의 발현을 확인했지만 OLFM4 mRNA는 검출할 수 없었습니다 (도시되지 않음). 마지막으로, ALDH1a1 mRNA는 매시 시점에서 스페로이드로 표현되었고 D10에서 감소하는 발현 프로파일을 보였으며, 수준은 D3(도8)에비해 약간 유의하다. 암세포 생물학을 연구하기 위한 새로운 모델의 적합성을 검증하기 위해, 화학요법에 대한 반응은 FOLFOX 또는 FOLFIRI로 치료된 스페로이드에서 분석되었으며, CRC 환자에게 일상적으로 투여되는 조합요법(22,23,24,25). 먼저, 세포사멸유도에 있는 치료의 효능은 구체적으로 죽은세포(26)로들어가는 형광 핵산 얼룩으로 스페로이드를 배양함으로써 검사되었다. 대조군 NT 조건에 비해, 각 약물을 가진 치료는 형광의 축적에 의해 측정된 상당한 세포 사멸을 유도하였다(도9A). 이러한 관찰은 또한 살아있는 현미경 검사를 사용하여 형태학적 수준에서 확인되었으며, 이는 치료가 스페로이드(도9B)의크기와 모양에 강하게 영향을 미치는 것으로 나타났다. 마지막으로, SC/CSC 마커의 발현은 동일한 조건하에서 스페로이드에서 qRT-PCR에 의해 분석되었다(도9C). 흥미롭게도, FOLFOX와 FOLFIRI 조건 하에서 PROM1 mRNA 수준에 있는 중요한 감소는 대조군을 위한 수준에 비해 관찰되었습니다, 반면 MSI1 수준은 처리에 의해 영향을 받지 않았습니다. 더욱이, FOLFOX는 대조군과 비교하여 ALDH1a1 mRNA 발현에 영향을 미치지 않은 반면, FOLFIRI를 통한 치료는 그 수준을 크게 증가시켰습니다. OLFM4 mRNA는 검출되지 않았고, CD44 mRNA 수준은 매우 낮았다(데이터는 도시되지 않음).
그림 1: 스페로이드 배양의 설정. (A)카코2 세포의 표시 농도로부터 시작된 스페로이드 형성per 스페로이드/마이크로웰. 상단 패널은 문화의 이틀 후 전체 문화 판의 대표 이미지를 보여줍니다. 하단 패널은 조건당 선택한 마이크로웰의 이미지를 보여줍니다. 이미지는 4배 배율(마이크로웰 크기: 400 μm)에서 촬영하였다. 스케일 바: 낮은 배율, 100 μm; 높은 배율, 30 μm. (B)마이크로웰당 다양한 수의 세포로부터 생성되고 상이한 시간 지점에서 분석된 스페로이드의 성장 특성. 표시된 일에는 마이크로웰의 첫 이틀 간의 배양과 아가로즈 코팅 플레이트에서 수확된 스페로이드의 후속 문화가 포함됩니다. 히스토그램은 표준 편차, n = 4-6을 ± 것을 의미합니다. 검은 색 원은 개별 스페로이드의 값을 표시합니다. 추정 부피에 대한 수식은 패널의 상부에 표시되며, 여기서 d1, d2 및 d3는 각 스페로이드에 대해 측정된 세 직경을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 스페로이드 형성 및 문화에 대한 조건의 최적화. (A)새로운 잘 준비 및 배양 매체 조건을 사용하여 미생물(2일)과 아가로 코팅 요리(5일)에서 회복후 D7에서 의 스페로이드의 대표적인 이미지. 스케일 바: 30 μm. (B)마이크로웰에서 세포 배양이 시작된 지 이틀 후에 갓 수확한 스페로이드의 추정 부피. 히스토그램은 표준 편차(SD), n = 4-6을 ± 것을 나타낸다. 검은 색 원은 개별 스페로이드의 크기를 나타냅니다. (C)새로 선택된 조건에 기초하여 장기 배양에서 스페로이드의 추정 부피. 그래프는 스페로이드 당 세포의 다른 수에서 생성 된 스페로이드의 성장 특성을 보여주고 그들의 수확 후 다른 시간 지점에서 분석, 지시된 바와 같이. 히스토그램 쇼는 sD, n = 6-10을 ± 의미합니다. 검은 색 원은 개별 스페로이드의 크기를 나타냅니다. (D)실험 시간 과정(오른쪽 패널)을 통해 및 마이크로웰(왼쪽 패널) 내에서 스페로이드 조건당 선택된 600개의 세포의 대표적인 이미지. 이미지는 4배 배율로 촬영되었습니다. 스케일 바: 낮은 배율, 100 μm; 높은 배율, 30 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 스페로이드의 조직학적 특성화. 파라핀 섹션의 조직학적 혈소슬린과 에오신 (H&E) 염색. 표시된 대로 수확 후 표시된 시간 지점에서 스페로이드의 대표적인 이미지. 각 높은 배율 인셋의 검은 점선은 스페로이드 내의 루멘을 구분합니다. 스케일 바: 낮은 배율, 30 μm; 높은 배율, 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 면역 라벨링에 의한 카코2 스페로이드 특성화. 증식 마커용 스페로이드의 면역염색, 증식 세포 핵항원(PCNA, 적색), 및 세포사멸 마커, 활성화된 카스파제 3(녹색) (왼쪽 패널) 및 β 카테닌(red) (오른쪽 패널)에 대해 표시된 시간에. 이미지는 PCNA (빨간색), 활성화 된 카스파스 3 (녹색), 핵 (파란색) 또는 β 카테닌 (빨간색) 및 핵 (파란색)의 병합 된 라벨링을 보여줍니다. 백색 화살표는 β 카세닌의 상부를 표현하는 세포의 세포 또는 단을 가리킵니다. 이미지는 20배의 목표로 촬영되었습니다. 스케일 바: 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: qRT-PCR에 의한 장신구 분화 마커의 분석. ALPI와 SLC2A5의 분석은 각각 알칼리성 인산염 및 GLUT5 단백질을 인코딩합니다. 히스토그램은 ACTB에대한 정규화 후 표준 편차, n = 3± 평균을 나타낸다. 데이터는 일반 결장 점막(빨간색 선 = 1)에 비해 접힌 변화로 표현됩니다. NS: 중요하지 않음; MS: 짝을 이루지 못한 학생의 t-test에의한 D3와 비교하면 약간 중요합니다. 약어: qRT-PCR = 정량적 역전사-폴리머라제 연쇄 반응; GLUT5 = 포도당 수송기 5; SLC2A5 = 솔루트 캐리어 패밀리 2, 성적 증명서 변형 2; ACTB = β 액틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 스페로이드에서 줄기 세포 마커, CD44 및 CD133의 이질적 발현. 줄기 세포 마커, CD133 및 CD44에 대한 면역 염색, 표시된 시간에. 왼쪽 패널의 이미지는 CD133(녹색) 및 핵(파란색)의 병합된 라벨링을 보여 준다. 오른쪽 패널의 동일한 이미지는 CD44(빨간색) 및 핵(파란색)의 병합된 라벨링을 보여 준다. 왼쪽 패널의 녹색 화살표는 CD133 발현 세포를 가리키며, 두 패널의 흰색 화살표는 CD44 및 CD133을 발현하는 세포 또는 세포 그룹을 가리킵니다. 이미지는 20배의 목표로 획득되었습니다. 스케일 바: 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 줄기 세포 마커, MSI1, 스페로이드의 이질적 발현. 줄기 세포 마커 MSI1 (빨간색)에 대한 면역 염색은 표시된 시간에. 이미지는 MSI1 (빨간색) 및 핵 (파란색)의 병합 된 라벨링을 보여줍니다. 백색 점선은 세포가 MSI1 면역 라벨링에 대해 양성인 일부 토굴 과 같은 구조를 강조합니다. 이미지는 20배 배율로 촬영되었습니다. 스케일 바: 5 μm. 약어 = MSI1 = 무사시 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: qRT-PCR에 의한 줄기 세포 마커 의 분석. PROM1, CD44, MSI1 및 ALDH1a1 수준의 정량화는 표시된 시간에 스페로이드로부터 mRNA에서 수행되었다. 히스토그램은 ACTB에대한 정규화 후 표준 편차, n = 3± 평균을 나타낸다. 데이터는 일반 결장 점막(빨간색 선 = 1)에 비해 접힌 변화로 표현됩니다. NS: 중요하지 않음; MS: D3에 비해 약간 중요하며, 짝을 이루지 않은 학생의 t-test를 사용했습니다. *: P < 0.05 D3 또는 D5에 비해, 짝이 없는 학생의 t-test를사용 하 여. 약어: qRT-PCR = 정량적 역전사-폴리머라제 연쇄 반응; PROM1 = 프로미닌-1; MSI1 = 무사시 1; ALDH1α1 = 알데히드 탈수소효소 1 알파; ACTB = β 액틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 스페로이드에 화학 요법의 효과. 마이크로웰에서 수확한 후, 스페로이드는 아가로즈 코팅 플레이트에서 배양되어 FOLFOX 또는 FOLFIRI로 3일 동안 처리되거나 (대조) 비처리(NT) 상태로 유지되었다. (A)죽은 세포에서 핵산의 라벨링으로 인한 형광 분석. 히스토그램은 표준 편차(SD), n = 4를 ± 것을 의미한다. (B)다양한 배양 조건에서 유지되는 스페로이드의 형태학적 특징. 이미지는 4배의 목표로 촬영되었습니다. 스케일 바: 400 μm. (C)QRT-PCR에 의한 PROM1, MSI1 및 ALDH1a1 mRNAs의 정량화. 히스토그램은 ACTB에대한 정규화 후 SD, n = 4 ± 의미합니다. *: NS: 중요하지 않음; P < 0.05; **: P < 0.01; : P < 0.001 대조군(NT) 상태에 비해, 짝이 없는 학생의 t-테스트를사용한다. 약어: FOLFOX = 5-플루오루라실, 50 μg/mL; 옥산스립라틴, 10 μg/mL; 류코보린, 25 μg/mL; FOLFIRI = 5-플루오루라실, 50 μg/mL; 이리노테칸, 100 μg/mL; 류코보린, 25 μg/mL; qRT-PCR = 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응; PROM1 = 프로미닌-1; MSI1 = 무사시 1; ALDH1α1 = 알데히드 탈수소효소 1 알파; ACTB = β 액틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 스페로이드 당 원하는 수의 세포 | 웰당 필요한 셀 수 |
| 50 | 6 x 104 |
| 100 | 1.2 x 105 |
| 200 | 2.4 x 105 |
| 300 | 3.6 x 105 |
| 400 | 4.8 x 105 |
| 500 | 6 x 105 |
| 600 | 7.2 x 105 |
| 700 | 8.4 x 105 |
| 800 | 9.6 x 105 |
| 1000 | 1.2 x 106 |
| 2000 | 2.4 x 106 |
표 1: 스페로이드 형성 및 세포 파종의 요약.
| 10mm 요리 | 6웰 플레이트 | 12웰 플레이트 | 24웰 플레이트 | 96웰 플레이트 | |
| 코팅 볼륨 | 4 mL | 300 μL | 250 μL | 150 μL | 50 μL(아래위 및 위) |
표 2: 다른 접시 / 요리의 코팅을위한 아가로즈 솔루션의 볼륨.
| 유전자 | 뇌관 | 순서 | 제품 길이 | |
| 차별화 마커 | ALPI | 전달 | CTG GTA CTC AGA TGC TGA CA | 81 |
| 후진 | ATG TTG 개그 ATG AGC TGA GT | |||
| SLC2A5 | 전달 | TAC CCA TAC TGG AAG GAT GA | 94 | |
| 후진 | AAC AGG ATC AGA GCA TGA AG | |||
| 줄기 세포 마커 | 알DH1a1 | 전달 | GCC TTC ACA GGA TCA ACA 개그 | 147 |
| 후진 | TGC AAA TTC AAC AGC ATT GTC | |||
| MSI1 | 전달 | AGT TGG CAG ACT ACG CAG GA | 131 | |
| 후진 | TGG TCC ATG AAA GTG ACG AAG | |||
| PROM1 | 전달 | GTA AGA ACC CGG ATC AAA AGG | 131 | |
| 후진 | GCC TTG TCC TTG GTA GTG TTG | |||
| CD44 | 전달 | TGC CTT TGA TGG ACC AAT TAC | 160 | |
| 후진 | TGA AGT GCT GCT CCT TTC ACT | |||
| OLFM4 | 전달 | TCT GTG TCC CAG TTG TTT TCC | 118 | |
| 후진 | ATT CCA AGC GTT CCA CTC TGT | |||
| 하우스키핑 유전자 | ACTB | 전달 | CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTT C | 134 |
| 후진 | AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T | |||
| PPIB | 전달 | ATG ATC CAG GGC GGA GAC TT | 100 | |
| 후진 | GCC CGT AGT GCT TCA GTT TG |
표 3: 정량적 역전사-폴리머라제 연쇄 반응에 사용되는 프라이머.
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Discussion
체외 3D 모델은 2D 암 세포 배양의 주요 실험적 단점을 극복, 그들은 미세 환경 과 세포 이질성을 포함한 전형적인 종양 기능을 다시 항복에 더 신뢰할 것으로 보인다. 일반적으로 사용되는 3D 스푸로이드 모델은 스캐폴드가 없는(저부착 조건에서 배양됨) 또는 스캐폴드 기반(생체 물질을 배양 세포에 사용)이다. 이러한 방법은 사용되는 비계의 특성에 의존하거나 구조와 크기가 가변적인 스페로이드를 발생시키기 때문에 서로 다른 단점을 제시합니다.
본 프로토콜은 스캐폴드 프리 방법을 이용하여 대장 아데노카르시노종 세포주, Caco2로부터 균질성 스페로이드를 생산하기 위한 조건을 최적화한 것으로 보고한다. 스페로이드는 쉽게 수확되고 이전에 보고된연구(41)와반대로, 성공적으로 성장하고 문화권 에 있는 시간 동안 그들의 성장 특성도 분석될 수 있다. 더욱이, 이러한 새로운 방법을 통해, 스페로이드(a)가 활발히 증식되고, (b) 세포사멸의 매우 낮은 비율을 제시하고, (c) 구체 내부의 루멘을 형성하기 위해 조직하고, (d) 성분 세포의 분화 능력을 나타낸다. 새로운 접근법의 최종 목적이 CSC 생물학에 대한 연구를 위한 사용이었다는 점을 감안할 때, CSC의 다른 마커의 발현을 분석하였다. 흥미롭게도 마커는 시간점에 따라 동적 식 패턴을 제시하고 서로 다른 CSC 집단을 정의했습니다.
가장 중요한 것은, 이 프로토콜을 통해 생성된 스페로이드는 화학요법 요법, FOLFOX 및 FOLFIRI와 같은 임상 응용에 관련있는 약을 분석하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 결과는 또한 분석된 CSC 마커에 따라서 약에 세포의 이기종 반응을 강조합니다. 이러한 관찰은 종양 내의 이질성 및 다중 CSC 유사 세포 집단이 다양한 화학민감성/화학저항 특성42,43을표시한다는 현재의견해와일치한다. 이 발견은 대규모 스크리닝을 위한 이 새로운 방법의 적용성을 강력하게 강력하게 합니다. 이 연구에서 보고된 응용 프로그램 외에도, 새로운 프로토콜은 광범위한 분석(예: RNA 및/또는 DNA 추출 및 대규모 분석, 서부 블로팅 및 면역 형광)에 사용될 수 있습니다. 실제로, 구체형 및 성장 특성의 부피는 필요한 경우 완벽하게 구형 형태로부터편차를 균형을 맞추기 위해 다른 직경을 고려하는 구체 부피 공식을 적용하여 쉽게 결정할 수 있다. 그러나, 특정 파라미터는 세포 유형(셀주 또는 신선한 1차 배양)과 복제 시간과 같은 성장 능력에 따라 최적화되어야 한다. 그럼에도 불구하고 이 프로토콜은 쉽게 조정할 수 있는 중요한 단계를 나타냅니다.
이 문서에 설명된 스페로이드 생성을 수행할 때 고려해야 할 몇 가지 관심사를 고려해야 합니다. 첫째, 구체의 균질성과 다짐을 촉진하기 위해 반준수 헹구는 용액으로 여러 가지 세척 단계를 수행해야 합니다. 이 경우 두 개의 세서그가 필요했습니다. 둘째, 스페로이드의 올바른 형성을 방해할 수 있기 때문에 마이크로웰에서 거품을 제거해야 합니다. 셋째, 원심분리 단계 후 각 마이크로웰에서 세포가 시드되면 플레이트는 2일 동안 방해받지 않고 유지되어야 합니다. 프로토콜의 추가 고려 사항 및 변경은 자동화된 시각화 및 이미징 시스템을 포함하여 스페로이드 형성의 초기 단계를 연구할 때 필요합니다. 넷째, 스페로이드를 방해하지 않고 배지를 변경하는 것은 어려울 수 있습니다. 따라서 매번 볼륨의 절반만 변경하는 것이 좋습니다. 다섯째, 스페로이드를 수확할 때, 그들의 구조를 보존하는 것이 중요하다. 따라서, 세로지학적 파이펫 이나 마이크로 파이펫을 팁 잘라 내어 서청구를 사용 하 여 혈청 함유 매체 또는 PBS에서 헹구후 모든 분배 단계에 대 한 권장 됩니다.
이 프로토콜을 사용할 때 몇 가지 제한 사항이 발생할 수도 있습니다. 첫째, 모든 세포주 또는 세포 유형이 동일한 배양 파라미터를 갖는 것은 아닙니다. 경우에 따라 세포 이질성 및 세포의 통로/노화 의 수는 또한 스페로이드를 형성하는 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 오르가노이드에 반대하게, 문화에서 매우 오랜 시간 동안 스페로이드를 유지하기 어려울 수 있습니다. 또한 마이크로 피펫팁(15)을통해 간단한 조각화로 복제할 수 없습니다. 셋째, 스페로이드를 하나씩 수동으로 복구하는 것은 까다로울 수 있으므로 이 프로토콜은 단일 스페로이드 해석에 맞게 조정할 수 없습니다. 이 기술은 동시에 균일 한 스페로이드의 높은 금액을 얻기위해 더 적합합니다. 마지막으로, 다른 세포 유형에서 유래한 성장 인자의 효과를 조사하거나 마이크로 환경의 중요성을 분석하는 연구를 위해서는 모델을 풍부하게 하고 공동 배양 실험을 수행하는 것이 중요합니다.
결론적으로, 본 방법론은 Caco2 세포에서 스페로이드를 효율적으로 생성하고 배양하기 위한 새로운 프로토콜을 설명합니다. 결과는 이 방법이 종양 이질성의 연구 결과 및 CSCs의 분석에 적용될 수 있다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 또한 암과 비암 세포에 있는 줄기 세포 생물학의 고처리량 약 검열 및 연구 결과에 이용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다
Acknowledgments
우리는 이미징 및 애니패스가 조직학 플랫폼(CRCL, CLB)을 재구성한다는 것을 인정합니다. 우리는 FOLFOX와 FOLFIRI의 친절한 선물을 위해 센터 레옹 베라드 (CLB) 병원의 약국에 빚지고 있습니다. 우리는 또한 원고의 비판적 독서에 대한 브리기테 맨십감사합니다. 이 작품은 FRM(Equipes FRM 2018, DEQ20181039598)과 Inca(PLBIO19-289)에 의해 지원되었습니다. MVG와 LC는 FRM의 지원을 받았고 CF는 ARC 재단과 센터 레옹 베라드의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | - | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA - Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin - Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
References
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