Isolation og analyse af Plasma Lipoproteiner ved Ultracentrifugation
Summary
Der er anvendt flere metoder til analyse af plasma lipoproteiner; Ultracentrifugation er dog stadig en af de mest populære og pålidelige metoder. Her beskriver vi en metode til at isolere lipoproteiner fra plasma ved hjælp af sekventiel tæthed ultracentrifugering og hvordan man analyserer apolipoproteinerne til både diagnostiske og forskningsmæssige formål.
Abstract
Analyse af plasma lipoproteiner og apolipoproteiner er en væsentlig del for diagnosticering af dyslipidemi og undersøgelser af lipidmetabolisme og åreforkalkning. Selv om der er flere metoder til analyse af plasma lipoproteiner, ultracentrifugation er stadig en af de mest populære og pålidelige metoder. På grund af sin intakte separationsprocedure kan lipoproteinfraktionerne isoleret ved denne metode bruges til analyse af lipoproteiner, apolipoproteiner, proteomer og funktionel undersøgelse af lipoproteiner med dyrkede celler in vitro. Her leverer vi en detaljeret protokol til at isolere syv lipoproteinfraktioner, herunder VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDLs (d=1,04 og 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1,10 og 1,21 g/mL) fra kaninplasma ved hjælp af sekventiel flydende ultracentrifugering. Derudover introducerer vi læserne, hvordan man analyserer apolipoproteiner som apoA-I, apoB og apoE af SDS-PAGE og Western blotting og viser repræsentative resultater af lipoprotein- og apolipoproteinprofiler ved hjælp af hyperlipidemiske kaninmodeller. Denne metode kan blive en standardprotokol for både klinikere og grundlæggende forskere til at analysere lipoproteinfunktioner.
Introduction
Dyslipidemi er den største risikofaktor for aterosklerotisk sygdom i verden. Høje niveauer af lipoproteiner med lav densitet (LDL’er) og lave niveauer af lipoproteiner med høj densitet (HDLs) er tæt forbundet med en høj risiko for koronar hjertesygdom (CHD)1,2. I den kliniske indstilling måles både LDL-kolesterol (LDL-C) og HDL-kolesterol (HDL-C) rutinemæssigt ved hjælp af en automatiseret analysator i et klinisk laboratorium3,4. På trods af dette er det vigtigt at analysere lipoproteinprofiler i detaljer til diagnosticering af dyslipidemi og studiet af lipidmetabolisme og åreforkalkning hos mennesker og forsøgsdyr. Flere metoder er blevet rapporteret til at analysere plasma lipoproteiner såsom ultracentrifugering, størrelse udelukkelse kromatografi [fast protein flydende kromatografi (FPLC) og højtydende flydende kromatografi (HPLC)], elektroforese af agarose og polyacrylamid geler, nukleare magnetiske resonans, og selektiv kemisk nedbør ved hjælp af polyanioner og divalent cations eller andre kemikalier. I 1950’erne foreslog Havels gruppe først begrebet lipoproteiner defineret ved tætheder ved hjælp af ultracentrifugering og klassificerede dem i chylomicrons (CM), lipoproteiner med meget lav densitet (VLDL), lipoproteiner med mellemdensitet (IDL), LDL og HDL5 og senere blev metoden yderligere ændret af andre grupper6,7. Indtil nu er ultracentrifugation den mest populære og pålidelige metode, mens den praktiske protokol stadig ikke er tilgængelig. I dette papir forsøgte vi at beskrive en brugervenlig protokol til isolering af en lille skala plasma ved hjælp af sekventiel tæthed flydende ultracentrifugering, der oprindeligt blev beskrevet tidligere8. Isolering af syv plasma lipoproteinfraktioner [VLDL (d<1,006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL'er (d=1,04 og 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1.10, og 1.21 g/mL)] gør det muligt for forskere at foretage en omfattende analyse af både lipoproteiner og deres kompositoriske apolipoproteiner9,10,11. Den intakte syv på hinanden følgende tæthed lipoproteiner kan bruges til at analysere lipoprotein funktioner og også tjener til celle-baserede in vitro strategier. Denne protokol bør være nyttig for både klinisk diagnose og grundforskning. Her brugte vi kaninplasma som et eksempel til at demonstrere denne teknik, mens plasma fra andre arter kan anvendes på samme måde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hyperlipidemi er en af de vigtigste risikofaktorer for aterosklerotisk sygdom. Således er analyse af plasma lipoproteiner ikke kun afgørende for diagnosticering af dyslipidemipatienter, men også vigtig for undersøgelse af molekylære mekanismer af lipoproteinmetabolisme og åreforkalkning. I denne undersøgelse beskrev vi protokollen for isolering og analyse af plasma lipoproteiner, som kan anvendes i de laboratorier, hvor ultracentrifugering er tilgængelig. Oplysninger indhentet ved denne metode er omfattende og li…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af et forskningstilskud fra JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, National Natural Science Foundation of China (nr. 81941001 og 81770457), JSPS-CAS under Japan-China Research Cooperative Program.
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
