Isolement et analyse des lipoprotéines plasmatiques par ultracentrifugation
Summary
Plusieurs méthodes ont été utilisées pour analyser les lipoprotéines plasmatiques; cependant, l’ultracentrifugation reste l’une des méthodes les plus populaires et fiables. Ici, nous décrivons une méthode concernant la façon d’isoler les lipoprotéines du plasma en utilisant l’ultracentrifugation séquentielle de densité et comment analyser les apolipoprotéines à des fins diagnostiques et de recherche.
Abstract
L’analyse des lipoprotéines et des apolipoprotéines de plasma est une partie essentielle pour le diagnostic de dyslipidémie et les études du métabolisme de lipide et de l’athérosclérose. Bien qu’il existe plusieurs méthodes pour analyser les lipoprotéines plasmatiques, l’ultracentrifugation reste l’une des méthodes les plus populaires et fiables. En raison de sa procédure intacte de séparation, les fractions de lipoprotéine isolées par cette méthode peuvent être employées pour l’analyse des lipoprotéines, des apolipoprotéines, des protéomes, et de l’étude fonctionnelle des lipoprotéines avec des cellules cultured in vitro. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour isoler sept fractions de lipoprotéine comprenant VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 et 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1,10 et 1,21 g/mL) provenant du plasma de lapin à l’aide d’ultracentrifugation flottante séquentielle. En outre, nous présentons aux lecteurs comment analyser les apolipoprotéines telles que l’apoA-I, l’apoB et l’apoE par SDS-PAGE et le ballonnement occidental et montrer des résultats représentatifs des profils de lipoprotéine et d’apolipoprotéine utilisant des modèles hyperlipidémiques de lapin. Cette méthode peut devenir un protocole standard pour les cliniciens et les scientifiques de base pour analyser les fonctions lipoprotéines.
Introduction
La dyslipidémie est le principal facteur de risque de maladie athéroclérotique dans le monde. Des niveaux élevés de lipoprotéines de basse densité (LDL) et de faibles niveaux de lipoprotéines de haute densité (HDLs) sont étroitement associés à un risque élevé de maladie coronarienne (CHD)1,2. En milieu clinique, le cholestérol LDL (LDL-C) et le cholestérol HDL (HDL-C) sont régulièrement mesurés à l’aide d’un analyseur automatisé dans un laboratoireclinique 3,4. Malgré cela, il est essentiel d’analyser les profils de lipoprotéine dans les détails pour le diagnostic de la dyslipidémie et l’étude du métabolisme lipidique et de l’athérosclérose chez les animaux humains et expérimentaux. Plusieurs méthodes ont été rapportées pour analyser des lipoprotéines de plasma telles que l’ultracentrifugation, la chromatographie d’exclusion de taille [chromatographie liquide de protéine rapide (FPLC) et chromatographie liquide de haute performance (HPLC)], électrophoresis par gels d’agarose et de polyacrylamide, résonance magnétique nucléaire, et précipitation chimique sélective utilisant des polyanions et des cations divalentes ou d’autres produits chimiques. Dans les années 1950, le groupe de Havel a proposé pour la première fois le concept de lipoprotéines définies par densités utilisant l’ultracentrifugation et les a classées en chylomicrons (CM), lipoprotéines de très faible densité (VLDL), lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL), LDL et HDL5 et plus tard, la méthode a été modifiée par d’autres groupes6,7. Jusqu’à présent, l’ultracentrifugation est la méthode la plus populaire et fiable alors que le protocole pratique n’est toujours pas disponible. Dans cet article, nous avons essayé de décrire un protocole facile à utiliser pour isoler une petite échelle de plasma utilisant l’ultracentrifugation flottante de densité séquentielle décrite à l’origineprécédemment 8. Isolement de sept fractions de lipoprotéine plasmatique [VLDL (d<1,006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL (d=1,04 et 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1,10 et 1,21 g/mL)] permet aux chercheurs de faire une analyse approfondie des lipoprotéines et de leurs apolipoprotéines compositionnelles9,10,11. Les sept lipoprotéines intactes de densité consécutive peuvent être employées pour analyser des fonctions de lipoprotéine et également servir aux stratégies in vitro basées sur la cellule. Ce protocole devrait être utile pour le diagnostic clinique et la recherche fondamentale. Ici, nous avons utilisé le plasma de lapin comme exemple pour démontrer cette technique tandis que le plasma d’autres espèces peut être appliqué de la même manière.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’hyperlipidémie est l’un des facteurs de risque les plus importants de la maladie athérosclérostique. Ainsi, l’analyse des lipoprotéines de plasma est non seulement essentielle pour le diagnostic des patients de dyslipidémie mais également importante pour l’investigation des mécanismes moléculaires du métabolisme de lipoprotéine et de l’athérosclérose. Dans cette étude, nous avons décrit le protocole d’isolement et d’analyse des lipoprotéines plasmatiques qui peuvent être appliquées dans l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus en partie par une subvention de recherche du numéro de subvention JP 20K08858 de JSPS KAKENHI, de la National Natural Science Foundation of China (no 81941001 et 81770457), du JSPS-CAS dans le cadre du Programme de coopération de recherche Japon-Chine.
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
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