Summary

超遠心分離による血漿リポタンパク質の単離と分析

Published: January 28, 2021
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Summary

血漿リポタンパク質の分析にはいくつかの方法が使用されています。しかし、超遠心は依然として最も人気があり、信頼性の高い方法の1つです。ここでは、逐次密度超遠心を用いて血漿からリポタンパク質を分離する方法と、診断と研究の両方の目的でアポリポタンパク質を分析する方法について説明する。

Abstract

血漿リポタンパク質とアポリポタンパク質の分析は、脂質異常症の診断や脂質代謝とアテローム性動脈硬化症の研究に不可欠な部分です。血漿リポタンパク質を分析するためのいくつかの方法がありますが、超遠心分離は依然として最も人気があり、信頼性の高い方法の1つです。その無傷の分離手順のために、この方法によって単離されたリポタンパク質の画分は、リポタンパク質、アポリポタンパク質、プロテオーム、および培養細胞を有するリポタンパク質の機能研究に使用することができる。ここでは、VLDL(d<1.006 g/mL)、IDL(d=1.02 g/mL)、LL(d=1.04および1.06 g/mL)、HDL(d=1.08、1.10、および1.21 g/mL)を含む7つのリポタンパク質画分をシーケンシャルプラズマを使用してシーケンシャルプラズマから分離するための詳細なプロトコルを提供します。また、SDS-PAGEやウエスタンブロッティングによるアポアI、apoB、apoEなどのアポリポタンパク質を分析する方法を読者に紹介し、過脂性ウサギモデルを用いたリポタンパク質およびアポリポタンパク質プロファイルの代表的な結果を示します。この方法は、臨床医と基本的な科学者の両方がリポタンパク質機能を分析するための標準的なプロトコルになることができます。

Introduction

脂質異常症は、世界の動脈硬化性疾患の主要な危険因子です。高濃度の低密度リポタンパク質(LDL)および低濃度の高密度リポタンパク質(HDL)は、冠状動脈性心疾患(CHD)1,2の高リスクと密接に関連している。臨床現場では、LDLコレステロール(LDL-C)とHDL-コレステロール(HDL-C)の両方が臨床検査室3,4の自動分析装置を用いて日常的に測定される。しかし、脂質異常症の診断やヒトおよび実験動物における脂質代謝とアテローム性動脈硬化症の研究については、リポタンパク質のプロファイルを詳細に分析することが不可欠です。超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー(高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、アガロースおよびポリアクリルアミドゲルによる電気泳動、核磁気共鳴、ポリアニオンおよび二価カチオンなどの選択的化学沈殿を分析する方法がいくつか報告されている。1950年代、Havelのグループは、最初に超遠心分離を使用して密度によって定義されるリポタンパク質の概念を提案し、それらをチロミクロン(CM)、非常に低密度リポタンパク質(VLDL)、中間密度リポタンパク質(IDL)、LDL、およびHDL5以降に分類し、この方法は他のグループ6、7によってさらに改変された。これまで、超遠心分離は最も一般的で信頼性の高い方法ですが、実用的なプロトコルはまだ利用できません。本稿では、先に説明した逐次密度の超遠心分離を用いて、微小なプラズマを単離するための使いやすいプロトコルを説明することを試みた。7つの血漿リポタンパク質画分の単離 [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LL (d=1.04 および 1.06 g/mL), HDL (d=1.08, 1.10、および1.21 g/mL))は、研究者がリポタンパク質とその組成アポリポタンパク質9、10、11の両方の広範な分析を行うことを可能にする。無傷の7つの連続した密度リポタンパク質は、リポタンパク質機能を分析し、また細胞ベースのインビトロ戦略にも役立つことができます。このプロトコルは、臨床診断と基礎研究の両方に有用である必要があります。ここでは、他の種からのプラズマを同じように適用しながら、この技術を実証するために、例としてウサギのプラズマを使用しました。

Protocol

ウサギ研究の全ての手続きは、山梨大学の制度的動物の世話・使用委員会(承認番号:A28-39)の承認を得て行われました。 1. ウサギの血からプラズマ分離 0.5 M EDTA (pH 8.0) の 15 μL を含む 1.5 mL マイクロチューブを採血用に準備します。 ウサギを拘束剤に入れ、22ゲージの針を使って耳介中動脈を穿刺し、血液をチューブに集める。EDTAと血液を優しく混ぜ、氷の?…

Representative Results

このプロトコルを用いて、1mLの血漿を用いてウサギのリポタンパク質を単離し、7つの密度画分を得た。分離された密度画分は、ほとんどの研究目的で上記のように脂質およびアポリポタンパク質を測定するのに十分である。同じ手順は、ヒトおよび他の種から血漿リポタンパク質を単離するためにも使用することができる。マウスなどの小型動物の場合、プールされた血漿が必要です。<stron…

Discussion

高脂血症は、アテローム硬化性疾患の最も重要な危険因子の1つです。したがって、血漿リポタンパク質の解析は、脂質異常症患者の診断に不可欠であるだけでなく、リポタンパク質代謝およびアテローム性動脈硬化症の分子機構の研究にも重要である。本研究では、超遠心分離が可能な研究室で適用できる血漿リポタンパク質の単離および分析のプロトコルについて説明した。この方法で得…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、日中研究協同プログラムのJSPS-CASである中国国立自然科学財団(第81941001、81770457)であるJSPS KAKENHIグラント番号JP 20K08858の研究助成金の一部によって支援されました。

Materials

22-gauge needle Terumo NN-2232S For blood collection
96-well microplate greiner bio-one 655101 For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibody LifeSpan BioSciences LS-C314186 For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibody ROCKLAND 600-101-111 For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibody Merck Millipore AB947 For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 299-50101 For apolipoprotein analysis
Centrifuge HITACHI himac CF15RN
Closure Spectrum 132736 For lipoprotein dialysis
Dialysis tubing FUJIFILM Wako Pure Chemical 043-30921 For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat block Major Science MD-01N For SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 For Western blotting
Electrophoresis Chamber BIO-RAD Mini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate FUJIFILM Wako Pure Chemical 345-01865 For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paper ADVANTEC 590 For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotor BECKMAN COULTER 357656 TLA-120.2
Fixing solution For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbrane BIO-RAD 1620177 For Western blotting
Lumino image analyzer GE Healthcare For Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrer ADVANTEC SR-304 For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARK BIO-RAD For lipids measurment
Microtube INA-OPTIKA SC-0150
Orbital agitator USBDbo Stovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibody Jackson ImmunoResearch 705-035-003 For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 715-035-150 For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 433-36201 For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge Tubes BECKMAN COULTER 343778
Potassium Bromide FUJIFILM Wako Pure Chemical 168-03475 For density solution
Power Supply BIO-RAD For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra BIO-RAD 161-0377 For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainer Natsume Seisakusho KN-318 For blood collection
Rotor HITACHI T15A43
SDS-PAGE running buffer 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x) 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel 4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powder FUJIFILM Wako Pure Chemical 190-12865 For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 439-17501 For lipids measurment
Triglyicerides assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 432-40201 For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tube BECKMAN COULTER 347960 For lipoprotein isolation
Tween 20 SIGMA-ALDRICH P1379 For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
Ultracentrifuge BECKMAN COULTER A95761 Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer system BIO-RAD Mini Trans-Blot Cell

References

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Cite This Article
Niimi, M., Yan, H., Chen, Y., Wang, Y., Fan, J. Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation. J. Vis. Exp. (167), e61790, doi:10.3791/61790 (2021).

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