Isolering och analys av plasma lipoproteiner genom ultracentrifugation

Summary

Flera metoder har använts för att analysera plasma lipoproteiner; Ultracentrifugation är dock fortfarande en av de mest populära och pålitliga metoderna. Här beskriver vi en metod för hur man isolerar lipoproteiner från plasma med hjälp av sekventiell densitet ultracentrifugation och hur man analyserar apolipoproteinerna för både diagnostiska och forskningsändamål.

Abstract

Analys av plasma lipoproteiner och apolipoproteiner är en viktig del för diagnos av dyslipidemi och studier av lipid metabolism och åderförkalkning. Även om det finns flera metoder för att analysera plasma lipoproteiner, är ultracentrifugation fortfarande en av de mest populära och tillförlitliga metoderna. På grund av dess intakta separation förfarande, lipoprotein fraktioner isolerade med denna metod kan användas för analys av lipoproteiner, apolipoproteiner, proteomer och funktionell studie av lipoproteiner med odlade celler in vitro. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att isolera sju lipoproteinfraktioner inklusive VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 och 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1,10 och 1,21 g/ml) från kaninplasma med sekventiell flytande ultracentrifugering. Dessutom introducerar vi läsarna hur man analyserar apolipoproteiner som apoA-I, apoB och apoE av SDS-PAGE och Western blotting och visar representativa resultat av lipoprotein- och apolipoproteinprofiler med hyperlipidemic kaninmodeller. Denna metod kan bli ett standardprotokoll för både kliniker och grundläggande forskare för att analysera lipoproteinfunktioner.

Introduction

Dyslipidemi är den största riskfaktorn för åderförd sjukdom i världen. Höga nivåer av lipoproteiner med låg densitet (LDLs) och låga nivåer av lipoproteiner med hög densitet (HDLs) är nära förknippade med en hög risk för kranskärlssjukdom (CHD)^1,2. I den kliniska inställningen mäts både LDL-kolesterol (LDL-C) och HDL-kolesterol (HDL-C) rutinmässigt med hjälp av en automatiserad analysator i ett kliniskt^{laboratorium 3,4}. Trots detta är det viktigt att analysera lipoproteinprofiler i detaljer för diagnos av dyslipidemi och studie av lipidmetabolism och åderförkalkning hos mänskliga och experimentella djur. Flera metoder har rapporterats för att analysera plasma lipoproteiner såsom ultracentrifugation, storlek uteslutning kromatografi [snabb protein flytande kromatografi (FPLC) och högpresterande flytande kromatografi (HPLC)], elektrofores av agarose och polyacrylamid geler, kärnmagnetisk resonans och selektiv kemisk nederbörd med hjälp av polyanioner och divalent cations eller andra kemikalier. På 1950-talet föreslog Havels grupp först begreppet lipoproteiner definierade av densiteter med ultracentrifugation och klassificerade dem i chylomicroner (CM), lipoproteiner med mycket låg densitet (VLDL), lipoproteiner med medelhög densitet (IDL), LDL och HDL⁵ och senare ändrades metoden ytterligare av andra grupper^6,7. Hittills är ultracentrifugation den mest populära och pålitliga metoden medan det praktiska protokollet fortfarande inte är tillgängligt. I detta dokument försökte vi beskriva ett lättanmåt anförande protokoll för att isolera en liten skala av plasma med sekventiell densitet flytande ultracentrifugation ursprungligen beskrivs tidigare⁸. Isolering av sju plasmalipoproteinfraktioner [VLDL (d<1,006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 och 1,06 g/ml), HDLs (d=1,08, 1,10 och 1,21 g/ml)] gör det möjligt för forskare att göra en omfattande analys av både lipoproteiner och deras kompositionella apolipoproteiner^9,10,11. De intakta sju på varandra följande densitet lipoproteiner kan användas för att analysera lipoprotein funktioner och även tjäna till cellbaserade in vitro strategier. Detta protokoll bör vara användbart för både klinisk diagnos och grundforskning. Här använde vi kaninplasma som exempel för att demonstrera denna teknik medan plasma från andra arter kan appliceras på samma sätt.

Protocol

Alla procedurer för kaninstudier utfördes med godkännande av University of Yamanashi Institutional Animal Care and Use Committee (Godkänt nummer: A28-39). 1. Plasmaseparation från kaninblod Förbered 1,5 ml mikrorör innehållande 15 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0) för blodinsamling. Sätt en kanin i en fasthållningshållare och punktera en auricular mellanliggande artär med en 22 gauge nål och samla blod i ett rör. Blanda blodet försiktigt med EDTA och lägg dem på is….

Representative Results

Med hjälp av detta protokoll isolerade vi kanin lipoproteiner med 1 ml plasma och erhöll sju densitet fraktioner. Isolerade densitetsfraktioner är tillräckliga för att mäta lipider och apolipoproteiner enligt beskrivningen ovan för de flesta forskningsändamål. Samma förfarande kan också användas för att isolera plasmalipoproteiner från människor och andra arter. För små djur som möss krävs poolad plasma. Figur 3 visar lipoproteinprofiler av vilda (WT) kaniner som matas ant…

Discussion

Hyperlipidemi är en av de viktigaste riskfaktorerna för åderförd sjukdom. Således är analys av plasma lipoproteiner inte bara avgörande för diagnos av dyslipidemi patienter men också viktigt för undersökning av molekylära mekanismer av lipoprotein metabolism och åderförkalkning. I denna studie beskrev vi protokollet om isolering och analys av plasma lipoproteiner som kan tillämpas i de laboratorier där ultracentrifugation är tillgänglig. Information som erhålls med denna metod är omfattande och enkel …

Materials

22-gauge needle	Terumo	NN-2232S	For blood collection
96-well microplate	greiner bio-one	655101	For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibody	LifeSpan BioSciences	LS-C314186	For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibody	ROCKLAND	600-101-111	For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibody	Merck Millipore	AB947	For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	299-50101	For apolipoprotein analysis
Centrifuge	HITACHI		himac CF15RN
Closure	Spectrum	132736	For lipoprotein dialysis
Dialysis tubing	FUJIFILM Wako Pure Chemical	043-30921	For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat block	Major Science	MD-01N	For SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagents	GE Healthcare	RPN2209	For Western blotting
Electrophoresis Chamber	BIO-RAD		Mini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	345-01865	For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paper	ADVANTEC	590	For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotor	BECKMAN COULTER	357656	TLA-120.2
Fixing solution			For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbrane	BIO-RAD	1620177	For Western blotting
Lumino image analyzer	GE Healthcare		For Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrer	ADVANTEC	SR-304	For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARK	BIO-RAD		For lipids measurment
Microtube	INA-OPTIKA	SC-0150
Orbital agitator USBDbo	Stovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	705-035-003	For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	433-36201	For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge Tubes	BECKMAN COULTER	343778
Potassium Bromide	FUJIFILM Wako Pure Chemical	168-03475	For density solution
Power Supply	BIO-RAD		For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra	BIO-RAD	161-0377	For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainer	Natsume Seisakusho	KN-318	For blood collection
Rotor	HITACHI		T15A43
SDS-PAGE running buffer			25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x)			0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel			4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powder	FUJIFILM Wako Pure Chemical	190-12865	For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	439-17501	For lipids measurment
Triglyicerides assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	432-40201	For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tube	BECKMAN COULTER	347960	For lipoprotein isolation
Tween 20	SIGMA-ALDRICH	P1379	For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A95761	Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer system	BIO-RAD		Mini Trans-Blot Cell