Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica
Summary
Dit protocol omvat een gedetailleerde analyse van de peptidoglycaansamenstelling met behulp van vloeistofchromatografie massaspectrometrie in combinatie met geavanceerde functie-extractie en bio-informatica-analysesoftware.
Abstract
Peptidoglycan is een belangrijk onderdeel van bacteriële celwanden en een gemeenschappelijk cellulair doelwit voor antimicrobiële stoffen. Hoewel aspecten van de peptidoglycaanstructuur redelijk bewaard zijn gebleven in alle bacteriën, is er ook een aanzienlijke variatie tussen Gram-positieven / negatieven en tussen soorten. Daarnaast zijn er tal van variaties, modificaties of aanpassingen aan de peptidoglycaan bekend die binnen een bacteriesoort kunnen optreden als reactie op groeifase en/of omgevingsprikkels. Deze variaties produceren een zeer dynamische structuur waarvan bekend is dat deze deelneemt aan vele cellulaire functies, waaronder groei / deling, antibioticaresistentie en het vermijden van gastheerverdediging. Om de variatie binnen peptidoglycaan te begrijpen, moet de algehele structuur worden opgesplitst in zijn constitutieve delen (bekend als muropeptiden) en worden beoordeeld op algemene cellulaire samenstelling. Peptidoglycomics maakt gebruik van geavanceerde massaspectrometrie in combinatie met krachtige bioinformatische data-analyse om de peptidoglycaansamenstelling in detail te onderzoeken. Het volgende protocol beschrijft de zuivering van peptidoglycaan uit bacterieculturen, de verwerving van muropeptide-intensiteitsgegevens via een vloeistofchromatograaf-massaspectrometer en de differentiële analyse van peptidoglycaansamenstelling met behulp van bio-informatica.
Introduction
Peptidoglycan (PG) is een bepalend kenmerk van bacteriën dat dient om de celmorfologie te behouden, terwijl het structurele ondersteuning biedt voor eiwitten en andere cellulaire componenten 1,2. De ruggengraat van PG bestaat uit afwisselend β-1,4-gebonden N-acetyl muramic acid (MurNAc) en N-acetyl glucosamine (GlcNAc)1,2. Elke MurNAc bezit een kort peptide gebonden aan het ᴅ-lactylresidu dat kan worden gekruist met aangrenzende disacharide-gekoppelde peptiden (figuur 1A,B). Deze crosslinking produceert een mesh-achtige structuur die de hele cel omvat en vaak een sacculus wordt genoemd (figuur 1C). Tijdens PG-synthese worden voorlopers gegenereerd in het cytoplasma en door flippasen over het cytoplasmamembraan getransporteerd. Voorlopers worden vervolgens opgenomen in de volwassen PG door transglycosylase en transpeptidase-enzymen, die respectievelijk de glycosidische en peptidebindingen produceren3. Eenmaal geassembleerd, zijn er echter tal van enzymen geproduceerd door de bacteriën die de PG wijzigen en / of afbreken om een aantal cellulaire processen uit te voeren, waaronder groei en deling. Bovendien is aangetoond dat verschillende modificaties van de PG aanpassingen geven die specifiek zijn voor de stam, groeiomstandigheden en omgevingsstress, die betrokken zijn bij celsignalering, antimicrobiële resistentie en immuunontwijking van de gastheer4. Een veel voorkomende modificatie is bijvoorbeeld de toevoeging van een C6-acetylgroep op de MurNAc die resistentie verleent door de toegang tot de glycaan-β-1,4-bindingen te beperken tot door de gastheer geproduceerde lysozymenzymen die PG 4,5,6 afbreken. Bij Enterokokken verleent substitutie van de terminale ᴅ-Ala van de peptide-sidechain door ᴅ-Lac een grotere resistentie tegen de antimicrobiële vancomycine 7,8.
De algemene procedure voor PG-isolatie en -zuivering is relatief ongewijzigd gebleven sinds deze in de jaren 1960 werd beschreven9. Bacteriële membranen worden opgelost door warmtebehandeling met SDS, gevolgd door enzymatische verwijdering van gebonden eiwitten, glycolipiden en overblijvend DNA. De gezuiverde intacte sacculus kan vervolgens worden verteerd tot de afzonderlijke componenten door hydrolyse van de β-1,4 koppeling tussen GlcNAc en MurNAc. Deze vertering produceert GlcNAc-MurNAc-disachariden met intacte structurele wijzigingen en/of crosslinks en worden muropeptiden genoemd (figuur 1B).
Compositieanalyse van PG werd aanvankelijk uitgevoerd door middel van hogedrukvloeistofchromatografische scheiding (HPLC) om elk muropeptide te zuiveren, gevolgd door handmatige identificatie van muropeptiden10,11. Dit is sindsdien vervangen door vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS), die de detectiegevoeligheid verhoogt en de handmatige werklast van het zuiveren van elk individueel muropeptide vermindert. De tijdrovende en complexe aard van de handmatige identificatie van muropeptiden is echter een beperkende factor gebleven, waardoor het aantal uitgevoerde studies is afgenomen. In de afgelopen jaren met de opkomst van “omic” -technologieën, is geautomatiseerde LC-MS-functie-extractie een krachtig hulpmiddel geworden, waardoor snelle detectie en identificatie van individuele verbindingen in complexe monsters uit zeer grote datasets mogelijk is. Zodra de kenmerken zijn geïdentificeerd, vergelijkt bioinformatische software statistisch de variatie tussen monsters met behulp van differentiële analyse, waarbij zelfs minimale verschillen tussen de complexe dataset worden geïsoleerd en grafisch aan de gebruiker worden weergegeven. De toepassing van feature extraction software voor de analyse van PG samenstelling is nog maar net begonnen te worden onderzocht 12,13,14 en gekoppeld aan bioinformatica analyse 12. In tegenstelling tot proteomische analyse, die profiteert van de direct beschikbare eiwitdatabases die peptidefragmentatie voorspellen, waardoor volledig geautomatiseerde identificatie mogelijk is, bestaat er momenteel geen fragmentatiebibliotheek voor peptidoglycomics. Functie-extractie kan echter worden gekoppeld aan bekende en voorspelde structurele databases om muropeptide-identificatie te voorspellen12. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van LC-MS-gebaseerde functie-extractie in combinatie met een muropeptidebibliotheek voor geautomatiseerde identificatie en bioinformatische differentiële analyse van PG-samenstelling (figuur 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode om peptidoglycaan uit bacterieculturen te zuiveren, te verwerken voor LC-MS-detectie en de samenstelling te analyseren met behulp van bio-informaticatechnieken. Hier richten we ons op Gram-negatieve bacteriën en zal een kleine aanpassing nodig zijn om analyse van Gram-positieve bacteriën mogelijk te maken.
De bereiding van muropeptiden is vrijwel hetzelfde gebleven sinds het voor het eerst werd geproduceerd in de jaren 1960 9,11,15.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Dr. Jennifer Geddes-McAlister en Dr. Anthony Clarke bedanken voor hun bijdragen aan het verfijnen van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door exploitatiesubsidies van CIHR toegekend aan C.M.K (PJT 156111) en een NSERC Alexander Graham Bell CGS D toegekend aan E.M.A. Cijfers werden gemaakt op BioRender.com.
Materials
| Equipment | |||
| C18 reverse phase column – AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) | Agilent | LC-MS data acquisition | |
| Heating mantle controller, Optichem | Fisher | 50-401-788 | for 4% SDS boil |
| Heating Mantle, 1000mL Hemispherical | Fisher | CG1000008 | for 4% SDS boil |
| Incubator, 37°C | for sacculi purification and MS sample prep | ||
| Leibig condenser, 300MM 24/40, | Fisher | CG121805 | for 4% SDS boil |
| Lyophilizer | Labconco | for lyophilization of sacculi | |
| Magentic stirrer | Fisher | 90-691-18 | for 4% SDS boil |
| mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 | Aglient | LC-MS data acquisition | |
| microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm | Fisher | 50-197-9573 | cleanup of sample before MS injection |
| Retort stand | Fisher | 12-000-102 | for 4% SDS boil |
| Retort clamp | Fisher | S02629 | for 4% SDS boil |
| round bottom flask – 1 liter pyrex | Fisher | 07-250-084 | for 4% SDS boil |
| Sonicator model 120 | Fisher | FB120 | for sacculi purification |
| Sonicator – micro tip | Fisher | FB4422 | for sacculi purification |
| Ultracentrifuge | Beckman | sacculi wash steps | |
| Ultracentrifuge bottles, Ti45 | Fisher | NC9691797 | sacculi wash steps |
| Water supply | City | for water cooled condenser | |
| Software | |||
| Chemdraw | Cambridgesoft | molecular editor for muropeptide fragmentation prediction | |
| Excel | Microsoft | viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc. | |
| MassHunter Acquisition | Aglient | running QTOF instrument | |
| MassHunter Mass Profiler Professional | Aglient | bioinformatic differential analysis | |
| MassHunter Personal Compound Database and Library Manager | Aglient | muropeptide m/z MS database | |
| MassHunter Profinder | Aglient | recursive feature extraction | |
| MassHunter Qualitative analysis | Aglient | viewing MS and MS/MS chromatograms | |
| Prism | Graphpad | Graphing software | |
| Perseus | Max Plank Institute of Biochemistry | 1D annotation | |
| Material | |||
| Acetonitrile | Fisher | A998-4 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637 | |
| Amylase | Sigma-Aldrich | A6380 | |
| Boric acid | Fisher | BP168-1 | |
| DNase | Fisher | EN0521 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 27001-500ML-R | |
| LC-MS tuning mix – HP0321 | Agilent | G1969-85000 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Nitrogen gas (>99% purity) | Praxair | NI 5.0UH-T | |
| Phosphoric acid | Fisher | A242 | |
| Pronase E from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| RNase | Fisher | EN0531 | |
| Sodium azide | Fisher | S0489 | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452890 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318 | |
| Sodium Phosphate (dibasic) | Fisher | S373 | |
| Sodium Phosphate (monobasic) | Fisher | S369 | |
| Stains-all | Sigma-Aldrich | E9379 |
References
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
- Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
- Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).
- Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
- Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).
- Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
- Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
- Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
- Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
- Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
- van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).
- Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
- Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
- Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
- Rusconi, F., Douard Valton, &. #. 2. 0. 1. ;., Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
- Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23 (2015).
- Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, 12 (2012).
- Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).
- Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
- Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
- Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
- Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
- Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).
- Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
- De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
- Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie – International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
- Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
- Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).
