Analyse semi-quantitative du peptidoglycane par chromatographie liquide Spectrométrie de masse et bioinformatique
Summary
Ce protocole couvre une analyse détaillée de la composition du peptidoglycane à l’aide de la spectrométrie de masse par chromatographie liquide couplée à un logiciel avancé d’extraction de caractéristiques et d’analyse bioinformatique.
Abstract
Le peptidoglycane est un composant important des parois cellulaires bactériennes et une cible cellulaire commune pour les antimicrobiens. Bien que certains aspects de la structure du peptidoglycane soient assez conservés dans toutes les bactéries, il existe également des variations considérables entre les Gram positifs/négatifs et entre les espèces. En outre, il existe de nombreuses variations, modifications ou adaptations connues du peptidoglycane qui peuvent se produire au sein d’une espèce bactérienne en réponse à une phase de croissance et / ou à des stimuli environnementaux. Ces variations produisent une structure très dynamique qui est connue pour participer à de nombreuses fonctions cellulaires, y compris la croissance / division, la résistance aux antibiotiques et l’évitement de la défense de l’hôte. Pour comprendre la variation au sein du peptidoglycane, la structure globale doit être décomposée en ses parties constitutives (appelées muropeptides) et évaluée pour la composition cellulaire globale. La peptidoglycomique utilise la spectrométrie de masse avancée combinée à une analyse de données bioinformatiques de haute puissance pour examiner la composition du peptidoglycane dans les moindres détails. Le protocole suivant décrit la purification du peptidoglycane à partir de cultures bactériennes, l’acquisition de données d’intensité de muropeptides par chromatographe liquide – spectromètre de masse et l’analyse différentielle de la composition du peptidoglycane à l’aide de la bioinformatique.
Introduction
Le peptidoglycane (PG) est une caractéristique déterminante des bactéries qui sert à maintenir la morphologie cellulaire, tout en fournissant un soutien structurel aux protéines et autres composants cellulaires 1,2. L’épine dorsale du PG est composée d’acide muramique N-acétyl lié au β-1,4-1,4 (MurNAc) et de N-acétyl glucosamine (GlcNAc)1,2. Chaque MurNAc possède un peptide court lié au résidu ᴅ-lactyle qui peut être réticulé avec des peptides adjacents liés au disaccharide (Figure 1A,B). Cette réticulation produit une structure en forme de maille qui englobe toute la cellule et est souvent appelée sacculus (Figure 1C). Au cours de la synthèse du PG, des précurseurs sont générés dans le cytoplasme et transportés à travers la membrane cytoplasmique par des flippases. Les précurseurs sont ensuite incorporés dans le PG mature par les enzymes transglycosylase et transpeptidase, qui produisent respectivementles liaisons glycosidique et peptidique3. Cependant, une fois assemblées, il existe de nombreuses enzymes produites par les bactéries qui modifient et / ou dégradent le PG pour effectuer un certain nombre de processus cellulaires, y compris la croissance et la division. En outre, il a été démontré que diverses modifications du PG confèrent des adaptations spécifiques à la souche, aux conditions de croissance et au stress environnemental, qui ont été impliquées dans la signalisation cellulaire, la résistance aux antimicrobiens et l’évasion immunitaire de l’hôte4. À titre d’exemple, une modification courante est l’ajout d’un groupe acétyle C6 sur le MurNAc qui confère une résistance en limitant l’accès aux liaisons glycane β-1,4 aux enzymes lysozymes produites par l’hôte qui dégradent PG 4,5,6. Chez les entérocoques, la substitution du ᴅ-Ala terminal de la chaîne latérale peptidique par ᴅ-Lac confère une plus grande résistance à l’antimicrobien, la vancomycine 7,8.
La procédure générale d’isolement et de purification des PG est restée relativement inchangée depuis qu’elle a été décrite dans les années 19609. Les membranes bactériennes sont dissoutes par traitement thermique avec SDS, suivi de l’élimination enzymatique des protéines liées, des glycolipides et de l’ADN restant. Le sacculus intact purifié peut ensuite être digéré en composants individuels par hydrolyse de la liaison β-1,4 entre GlcNAc et MurNAc. Cette digestion produit des disaccharides GlcNAc-MurNAc avec toutes les modifications structurelles et / ou réticulations intactes et sont appelés muropeptides (Figure 1B).
L’analyse de la composition du PG a d’abord été réalisée par séparation chromatographique liquide à haute pression (CLHP) pour purifier chaque muropeptide, suivie d’une identification manuelle des muropeptides10,11. Cela a depuis été remplacé par la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS), qui augmente la sensibilité de détection et diminue la charge de travail manuelle de purification de chaque muropeptide individuel. Cependant, la nature longue et complexe de l’identification manuelle des muropeptides est restée un facteur limitant, réduisant le nombre d’études menées. Ces dernières années, avec l’émergence des technologies « omiques », l’extraction automatisée de caractéristiques LC-MS est devenue un outil puissant, permettant la détection et l’identification rapides de composés individuels dans des échantillons complexes à partir de très grands ensembles de données. Une fois les caractéristiques identifiées, le logiciel bioinformatique compare statistiquement la variation entre les échantillons à l’aide d’une analyse différentielle isolant même les différences minimes entre les ensembles de données complexes et les affichant graphiquement à l’utilisateur. L’application de logiciels d’extraction de caractéristiques pour l’analyse de la composition PG vient tout juste de commencer à être explorée 12,13,14 et couplée à l’analyse bioinformatique 12. Contrairement à l’analyse protéomique qui bénéficie des bases de données de protéines facilement disponibles qui prédisent la fragmentation peptidique permettant une identification entièrement automatisée, il n’existe actuellement aucune bibliothèque de fragmentation pour la peptidoglycomie. Cependant, l’extraction de caractéristiques peut être couplée à des bases de données structurelles connues et prévues pour prédire l’identification des muropeptides12. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’utilisation de l’extraction de caractéristiques à base de LC-MS combinée à une bibliothèque de muropeptides pour l’identification automatisée et l’analyse différentielle bioinformatique de la composition PG (Figure 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode pour purifier le peptidoglycane à partir de cultures bactériennes, un procédé de détection LC-MS et une analyse de composition à l’aide de techniques bioinformatiques. Ici, nous nous concentrons sur les bactéries à Gram négatif et quelques légères modifications seront nécessaires pour permettre l’analyse des bactéries à Gram positif.
La préparation des muropeptides est restée pratiquement la même depuis sa première production dans les ann…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier la Dre Jennifer Geddes-McAlister et le Dr Anthony Clarke pour leur contribution au perfectionnement de ce protocole. Ces travaux ont été appuyés par des subventions de fonctionnement des IRSC accordées au C.M.K (PJT 156111) et une BESC Alexander Graham Bell du CRSNG décernée à l’EMA. Des figures ont été créées le BioRender.com.
Materials
| Equipment | |||
| C18 reverse phase column – AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) | Agilent | LC-MS data acquisition | |
| Heating mantle controller, Optichem | Fisher | 50-401-788 | for 4% SDS boil |
| Heating Mantle, 1000mL Hemispherical | Fisher | CG1000008 | for 4% SDS boil |
| Incubator, 37°C | for sacculi purification and MS sample prep | ||
| Leibig condenser, 300MM 24/40, | Fisher | CG121805 | for 4% SDS boil |
| Lyophilizer | Labconco | for lyophilization of sacculi | |
| Magentic stirrer | Fisher | 90-691-18 | for 4% SDS boil |
| mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 | Aglient | LC-MS data acquisition | |
| microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm | Fisher | 50-197-9573 | cleanup of sample before MS injection |
| Retort stand | Fisher | 12-000-102 | for 4% SDS boil |
| Retort clamp | Fisher | S02629 | for 4% SDS boil |
| round bottom flask – 1 liter pyrex | Fisher | 07-250-084 | for 4% SDS boil |
| Sonicator model 120 | Fisher | FB120 | for sacculi purification |
| Sonicator – micro tip | Fisher | FB4422 | for sacculi purification |
| Ultracentrifuge | Beckman | sacculi wash steps | |
| Ultracentrifuge bottles, Ti45 | Fisher | NC9691797 | sacculi wash steps |
| Water supply | City | for water cooled condenser | |
| Software | |||
| Chemdraw | Cambridgesoft | molecular editor for muropeptide fragmentation prediction | |
| Excel | Microsoft | viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc. | |
| MassHunter Acquisition | Aglient | running QTOF instrument | |
| MassHunter Mass Profiler Professional | Aglient | bioinformatic differential analysis | |
| MassHunter Personal Compound Database and Library Manager | Aglient | muropeptide m/z MS database | |
| MassHunter Profinder | Aglient | recursive feature extraction | |
| MassHunter Qualitative analysis | Aglient | viewing MS and MS/MS chromatograms | |
| Prism | Graphpad | Graphing software | |
| Perseus | Max Plank Institute of Biochemistry | 1D annotation | |
| Material | |||
| Acetonitrile | Fisher | A998-4 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637 | |
| Amylase | Sigma-Aldrich | A6380 | |
| Boric acid | Fisher | BP168-1 | |
| DNase | Fisher | EN0521 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 27001-500ML-R | |
| LC-MS tuning mix – HP0321 | Agilent | G1969-85000 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Nitrogen gas (>99% purity) | Praxair | NI 5.0UH-T | |
| Phosphoric acid | Fisher | A242 | |
| Pronase E from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| RNase | Fisher | EN0531 | |
| Sodium azide | Fisher | S0489 | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452890 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318 | |
| Sodium Phosphate (dibasic) | Fisher | S373 | |
| Sodium Phosphate (monobasic) | Fisher | S369 | |
| Stains-all | Sigma-Aldrich | E9379 |
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