利用计算机图像分析提高4T1乳腺癌模型中肺转移的定量
Summary
我们描述了一种更一致和快速的方法，通过使用 Fiji-ImageJ 来量化 4T1 乳腺癌模型中的肺转移。
Abstract
乳腺癌是一种毁灭性的恶性肿瘤，仅2019年就导致美国4万名女性死亡，占新诊断女性癌症的30%。乳腺癌相关死亡的主要原因为转移性负担。因此，乳腺癌的临床前模型需要分析转移性负担，以临床相关。4T1乳腺癌模型为第四阶段人类乳腺癌提供了一个自发转移的、可量化的小鼠模型。然而，大多数 4T1 协议通过手动计算组织培养板上的染色菌落来量化转移性负担。虽然这足以使转移负担较低的组织使用，但人工计数中的人为错误会导致板汇合且难以计数时的结果不一致和可变。此方法为人工计数错误提供了基于计算机的解决方案。在这里，我们使用肺（4T1模型中的一种高度转移性组织）来评估协议。在斐济-ImageJ中获取并上传甲基蓝染色板的图像进行分析。然后，Fiji-ImageJ 确定图像选定区域的百分比为蓝色，表示具有转移性负担的板的百分比。这种基于计算机的方法比对高度转移组织的手动计数或组织病理学评估更一致和快速的结果。Fiji-ImageJ 结果的一致性取决于图像的质量。图像之间可能会发生细微的结果变化，因此建议拍摄多个图像并计算结果平均值。尽管其局限性最小，但这种方法通过提供一致和快速的结果，对量化肺转移性负担进行了改进。
Introduction
八分之一的女性将在有生之年被诊断出患有乳腺癌，尽管有多种选择治疗，但乳腺癌是美国女性癌症相关死亡的第二大原因。这些妇女不会死于乳房的原发性肿瘤。相反，转移性负担是导致这种疾病的死亡，因为它通常蔓延到肺，骨，脑，肝脏和淋巴结2。因此，乳腺癌模型需要评估转移，以有助于遏制这种疾病的死亡率。4T1乳腺癌模型是一个极好的协议，以做到这一点。此处描述的方法通过使用 Fiji-ImageJ 量化肺转移，从而产生一致和快速的结果，从而改进了 4T1 模型。
4T1模型是成熟的，大多数实验室使用的协议，如那些由普拉斯基和奥斯特朗德-罗森博格在2001年3。4T1细胞系为6-硫冠宁（6TG）耐药，代表四期，三重阴性乳腺癌3，4，5。它是临床上相关的，因为它是一个正畸模型和自发转移到相同的器官，在人类乳腺癌3，4。4T1细胞根据注入的3，4细胞的数量，以可预测的速率自发转移。重要的是，这里使用的小鼠之间的遗传差异导致了转移性负担的预期个体间变异。为了评估转移，组织被收获，以收集和量化癌细胞在遥远的地点使用6TG选择和甲基蓝染色。其结果是组织培养板的集合与蓝点代表转移菌落。然而，普拉斯基和奥斯特朗-罗森博格协议通过手动计算转移菌落来量化它们，因此，这是评估该模型中转移的标准方法。虽然这对于转移性负担低的组织来说很容易，但像肺这样的组织往往充满了转移。由于肺板可以高度汇合，通过人工计数准确和精确地量化转移菌落是困难的，并且容易出现人为错误。为了更好地量化转移性负担，我们描述使用 Fiji-ImageJ 作为基于计算机的人工计数误差解决方案。与血氧林和eosin（H&E）染色的组织病理学分析是量化肺转移的另一种手段，有趣的是，斐济-ImageJ软件6，7也改进了。然而，由于组织病理学分析观察肺的一片，它可以是不准确和不具代表性的。这是因为4T1模型导致整个器官的一些转移性病变，这些病变分布不均匀。虽然组织病理学分析和人工计数之间的总体趋势可能相似，但单个值可能不同，因此组织病理学分析不应作为唯一的量化手段。我们演示了与组织病理学分析相比的好处，以及不同计数器之间手动计数的不一致，同时也展示了使用 Fiji-ImageJ 的一致性。此外，我们表明，这种方法可以减少孵化时间从10-14天到5天，这意味着研究人员可以分析数据从他们的研究比当依靠手动计数更快。
此方法是普拉斯基和奥斯特朗-罗森博格协议3的简单调整的集合。由于4T1模型被广泛使用，并且肺转移是临床前模型中测量的关键参数，我们相信这种方法可以被广泛使用，对乳腺癌研究人员具有很高的价值。唯一需要的额外用品是一台照相机和访问计算机与斐济-ImageJ，一个自由软件经常使用的图像分析9。这种方法特别侧重于肺转移，但它可用于其他组织与严重的转移负担。
Protocol
Representative Results
Discussion
如所示，手动计算每个肺板上的转移菌落可能是一种不准确和不精确的方法来量化肺转移，表明需要更好的定量方法（图2）。组织病理学分析与人工计数和斐济-ImageJ分析（图2B和4D）略有不同，可能是因为H&E幻灯片不是整个器官的代表性样本。该协议收获整个肺，因此更代表总肺转移，比手动计数更一致。尝试了几种不同的斐济-ImageJ分析?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了弗吉尼亚-马里兰兽医学院（IA）、弗吉尼亚理工大学工程健康应用科学中心（IA）和国家卫生研究院R21EB028429（IA）的支持。
Materials
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 1 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
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- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
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