Utilisation de l’analyse d’image informatisation pour améliorer la quantification des métastases pulmonaires dans le modèle 4T1 du cancer du sein
Summary
Nous décrivons une méthode plus cohérente et expéditieuse pour quantifier la métastase pulmonaire dans le modèle de cancer du sein 4T1 en utilisant Fiji-ImageJ.
Abstract
Le cancer du sein est une malignité dévastatrice, représentant 40 000 décès de femmes et 30 % des nouveaux diagnostics de cancer féminin aux États-Unis pour la seule année 2019. La principale cause de décès liés au cancer du sein est la charge métastatique. Par conséquent, les modèles précliniques pour le cancer du sein doivent analyser le fardeau métastatique pour être médicalement pertinents. Le modèle de cancer du sein 4T1 fournit un modèle de souris spontanément métastasante et quantifiable pour le cancer du sein humain de stade IV. Cependant, la plupart des protocoles 4T1 quantifient la charge métastatique en comptant manuellement les colonies tachées sur les plaques de culture tissulaire. Bien que cela soit suffisant pour les tissus ayant une charge métastatique inférieure, l’erreur humaine dans le comptage manuel provoque des résultats incohérents et variables lorsque les plaques sont confluentes et difficiles à compter. Cette méthode offre une solution informatique à l’erreur de comptage humain. Ici, nous évaluons le protocole à l’aide du poumon, un tissu hautement métastatique dans le modèle 4T1. Des images de plaques tachées de méthylène sont acquises et téléchargées pour analyse dans Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ détermine ensuite le pourcentage de la zone sélectionnée de l’image bleue, représentant le pourcentage de la plaque avec charge métastatique. Cette approche informatisée offre des résultats plus cohérents et rapides que le comptage manuel ou l’évaluation histopathologique pour les tissus hautement métastatiques. La cohérence des résultats fiji-imagej dépend de la qualité de l’image. De légères variations de résultats entre les images peuvent se produire, il est donc recommandé que plusieurs images soient prises et que les résultats soient en moyenne. Malgré ses limites minimales, cette méthode est une amélioration de la quantification du fardeau métastatique dans le poumon en offrant des résultats cohérents et rapides.
Introduction
Une femme sur huit recevra un diagnostic de cancer du sein au cours de sa vie, et pourtant, malgré de multiples options de traitement, le cancer du sein est la deuxième cause de décès liés au cancer chez les femmesaméricaines 1. Ces femmes ne meurent pas de la tumeur primaire dans leur sein. Au lieu de cela, la charge métastatique est responsable de la mortalité de cette maladie car elle se propage généralement au poumon, à l’os, au cerveau, au foie, et aux ganglions lymphatiques2. Pour cette raison, les modèles de cancer du sein doivent évaluer les métastases pour contribuer à réduire la mortalité de cette maladie. Le modèle 4T1 murine cancer du sein est un protocole superbe pour y parvenir. La méthode décrite ici offre une amélioration du modèle 4T1 en utilisant Fiji-ImageJ pour quantifier la métastase pulmonaire, produisant des résultats cohérents et rapides.
Le modèle 4T1 est bien établi, la plupart des laboratoires utilisant des protocoles tels que ceux décrits par Pulaski et Ostrand-Rosenberg en 20013. La lignée cellulaire 4T1 est résistante à la 6-Thioguanine (6TG) et représentative du stade IV, triple cancer du seinnégatif 3,4,5. Il est cliniquement pertinent car il est un modèle orthotopique et métastase spontanément aux mêmes organes que dans le cancer du seinhumain 3,4. Les cellules 4T1 métastasent spontanément à un rythme prévisible basé sur la quantité de cellules injectées3,4. Fait important, les différences génétiques entre les souris utilisées ici ont causé la variabilité inter-individuelle prévue dans la charge métastatique. Pour évaluer la métastase, les tissus sont récoltés pour recueillir et quantifier les cellules cancéreuses dans des sites éloignés à l’aide de la sélection 6TG et de la coloration bleue du méthylène. Le résultat est une collection de plaques de culture tissulaire avec des points bleus représentant des colonies métastatiques. Cependant, le protocole Pulaski et Ostrand-Rosenberg quantifie les colonies métastatiques en les comptant manuellement, et c’est donc le moyen standard d’évaluer les métastases dans ce modèle. Bien que cela soit facile pour les tissus à faible charge métastatique, les tissus comme les poumons sont souvent chargés de métastases. Comme les plaques pulmonaires peuvent être très confluentes, la quantification précise et précise des colonies métastatiques par comptage manuel est difficile et sujette à l’erreur humaine. Pour mieux quantifier le fardeau métastatique, nous décrivons l’utilisation de Fiji-ImageJ pour une solution informatique à l’erreur de comptage humain. L’analyse histopathologique avec la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) est un autre moyen de quantifier les métastases pulmonaires, et il est intéressant de l’améliorer avec le logiciel Fiji-ImageJ6,7. Cependant, parce que l’analyse histopathologique observe une seule tranche du poumon, elle peut être inexacte et non représentative. C’est parce que le modèle 4T1 provoque plusieurs lésions métastatiques dans tout l’organe qui ne sont pas réparties uniformément. Alors que les tendances globales entre l’analyse histopathologique et le comptage manuelpeuvent être similaires 8, les valeurs individuelles peuvent différer et donc l’analyse histopathologique ne doit pas être utilisée comme seul moyen de quantification. Nous démontrons l’avantage par rapport à l’analyse histopathologique et aux incohérences dans le comptage manuel entre les différents compteurs, tout en démontrant la cohérence de l’utilisation de Fiji-ImageJ. En outre, nous montrons que cette méthode peut réduire le temps d’incubation de 10-14 jours à 5 jours, ce qui signifie que les chercheurs peuvent analyser les données de leur étude beaucoup plus tôt que lorsqu’ils s’appuient sur le comptage manuel.
Cette méthode est une collection d’ajustements simples au protocole Pulaski et Ostrand-Rosenberg3. Parce que le modèle 4T1 est largement utilisé, et parce que la métastase pulmonaire est un paramètre critique à mesurer dans les modèles précliniques, nous croyons que cette méthode peut être largement utilisée et est très précieuse pour les chercheurs sur le cancer du sein. Les seules fournitures supplémentaires nécessaires sont une caméra et l’accès à un ordinateur avec Fiji-ImageJ, un logiciel libre fréquemment utilisé dans l’analyse d’images9. Cette méthode se concentre spécifiquement sur la métastase pulmonaire, mais elle pourrait être utilisée pour d’autres tissus avec une charge métastatique significative.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme démontré, compter manuellement les colonies métastatiques sur chaque plaque pulmonaire peut être une méthode inexacte et imprécise pour quantifier les métastases pulmonaires, démontrant la nécessité d’un meilleur moyen de quantification (figure 2). L’analyse histopathologique différait légèrement du comptage manuel et de l’analyse Fiji-ImageJ(figure 2B et 4D),probablement parce que les diapositives H&E ne sont pas un éc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par le Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), le Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) et les National Institutes of Health R21EB028429 (IA).
Materials
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 1 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).
- Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
- Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
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- ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).
