Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Studere TGF-β signalisering og TGF-β-indusert epitel-til-mesenchymal overgang i brystkreft og normale celler

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61830
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Oncode Institute and Department of Cell Chemical Biology, Leiden University Medical Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Vi beskriver en systematisk arbeidsflyt for å undersøke TGF-β signalisering og TGF-β-indusert EMT ved å studere protein og genuttrykk involvert i denne signalveien. Metodene inkluderer vestlig blotting, en luciferase reporter analyse, qPCR, og immunofluorescence flekker.

Abstract

Transforming vekstfaktor-β (TGF-β) er en utskillelig multifunksjonell faktor som spiller en nøkkelrolle i intercellulær kommunikasjon. Perturbasjoner av TGF-β signalisering kan føre til brystkreft. TGF-β fremkaller dens effekter på spredning og differensiering via spesifikk celleoverflate TGF-β type I og type II reseptorer (det vil si TβRI og TβRII) som inneholder en egen serine/threonine kinase domene. Ved TGF-β-indusert heteromerisk kompleks formasjon, aktivert TβRI fremkaller intracellulær signalisering ved fosforylering SMAD2 og SMAD3. Disse aktiverte SMADs danner heteromeriske komplekser med SMAD4 for å regulere spesifikke målgener, inkludert plasminogenaktiveringshemmer 1 (PAI-1, kodet av SERPINE1-genet). Induksjonen av epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) tillater epitelkreftceller på det primære stedet eller under kolonisering på fjerne steder for å få en invasiv fenotype og drive tumorprogresjon. TGF-β fungerer som en potent induktor av brystkreft invasjon ved å kjøre EMT. Her beskriver vi systematiske metoder for å undersøke TGF-β signal- og EMT-responser ved hjelp av premalignant humane MCF10A-RAS (M2) celler og mus NMuMG epitelceller som eksempler. Vi beskriver metoder for å bestemme TGF-β-indusert SMAD2 fosforylering ved vestlig blotting, SMAD3/SMAD4-avhengig transkripsjonsaktivitet ved hjelp av luciferase reporteraktivitet og SERPINE1-målgenuttrykk ved kvantitativ sanntidspolymerasekjedereaksjon (qRT-PCR). I tillegg er metoder beskrevet for å undersøke TGF-β-indusert EMT ved å måle endringer i morfologi, epitel- og mesenchymal markøruttrykk, filamentøs aktinfarging og immunofluorescence farging av E-kaderin. To selektive små molekyl TGF-β reseptor kinase hemmere, GW788388 og SB431542, ble brukt til å blokkere TGF-β-indusert SMAD2 fosforylering, mål gener og endringer i EMT markør uttrykk. Videre beskriver vi transdifferentiation av mesenchymal bryst Py2T murine epiteltumceller i adipocytter. Metoder for å undersøke TGF-β-indusert signalering og EMT i brystkreft kan bidra til nye terapeutiske tilnærminger for brystkreft.

Introduction

Cytokin transformere vekstfaktor-β (TGF-β) er prototypen av en stor gruppe strukturelt og funksjonelt relaterte regulatoriske polypeptider inkludert TGF-βs (det vil si TGF-β1, -β2 og -β3), bein morfogene proteiner (BMPs) ogaktiviner 1,2. Disse cytokinene spiller alle viktige roller i embryonisk utvikling og i å opprettholde vev og organ homeostase3. Feilreguleringen av TGF-β kan føre til et stort utvalg av sykdommer, inkludert kreft4,5. TGF-β spiller en kompleks, dobbel rolle i kreftprogresjon: i normale og premalignant epitelceller oppfører TGF-β seg som en tumorsuppressor ved å hemme spredning og indusere apoptose6,7; men på slutten av tumorprogresjonen, når cytostatiske responser er blokkert ved aktivering av onkogener eller tap av tumorsuppressorgener, fungerer TGF-β som en tumorforsterker ved å fremme epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) i kreftceller, og dermed muliggjør kreftcelleinvasjon og metastase, som virker på celler i tumormikromiljøet og stimulerende angiogenese og immununndragelse8,9,10.

TGF-β utskilles som et inaktivt forløpermolekyl som inneholder den modne karboksy-terminal TGF-β og latens-assosiert peptid (LAP)11. Dette lille komplekset kan være kovalent bundet av latent TGF-β-bindende protein (LTBP)12. Utgivelsen av modne TGF-β kan medieres ved virkningen av spesifikke proteaser som cleave LAP eller ved mekanisk trekking av LAP i en integrin-avhengig prosess13,14. I tillegg til LTBP, Glycoprotein En repetisjoner dominerende (GARP) er høyt uttrykt på overflaten av regulatoriske T-celler (Tregs) og spiller en lignende rolle som LTBP i å regulere aktiveringen av TGF-β15,16. GARP binder seg direkte til latent TGF-β gjennom disulfid kobling og ikke-kovalent forening. Aktiveringen av TGF-β fra GARP/TGF-β-komplekset krever integrins17. Modne TGF-β binder seg til TGF-β serine/threonine kinase reseptorer, det vil si TGF-β type I (TβRI) og TGF-β type II (TβRII)reseptorer 18 å starte signalering. Bindingen av TGF-β til TβRII fremmer rekruttering av TβRI og dannelsen av et heteromerisk kompleks. Deretter er TβRI fosforylert av TβRII kinase på serin og sparoninrester i et kort glysin- og serinrikt (GS) motiv, noe som resulterer i aktivering19,20. Ved aktivering rekrutterer og fosforyler sine substrater: de to reseptorspesifikke SMADene (R-SMADs) som inkluderer SMAD2 og SMAD3 (figur 1). R-SMADs deler en lignende total struktur med to såkalte Mad homology domener, MH1 og MH2, som er atskilt med en proline-rik linker region (Figur 2). DNA-bindingsmotivet i MH1-domenet SMAD3 er ikke bevart mellom SMAD2 og SMAD3, og SMAD2 kan ikke binde DNA direkte på grunn av to innsettinger i MH1-domenet (exon 3 og L1). SMAD2 og SMAD3 kan aktiveres ved fosforylering av SSXS-motivet i deres C-termini (figur 2). Fosforylert SMAD2/3 danner heteromeriske komplekser med en vanlig SMAD-mekler, SMAD4, som translocates inn i kjernen for å modulere transkripsjonen av målgener (figur 1)7,21. Denne kanoniske SMAD signalveien er nettopp regulert og genererer spesifikke cellulære og vevsresponser som regulering av celleskjebne og tumorcellemetastase og invasjon22. I tillegg til TGF-β-SMAD-signalering, kan ikke-SMAD-signalveier også aktiveres direkte av reseptorer for å regulere nedstrøms cellulæreresponser 23.

Under tumorprogresjon er aktiveringen av TGF-β-induserte SMAD-avhengige og SMAD-uavhengige veier nødvendig for induksjon av EMT. EMT er en reversibel prosess der tumorceller dedifferentiate fra en epitelfenotype, som er forbundet med tap av cellecellekontakter og redusert apical-basal polaritet, til en mesenchymal fenotype med forbedret motilitet og invasjonsevne24. EMT er preget av økt uttrykk for mesenchymale markørproteiner, inkludert N-kadherin, vimentin, Zeb2 og Snail1/2, og samtidig nedregulering av epitelmarkører, som E-kadherin og β-catenin (figur 3)25. Overgangen fra en epitel til en mesenchymal tilstand er imidlertid ofte ufullstendig, og celler får blandede epitel- og mesenchymale (E/M) egenskaper. En fersk artikkel fra International EMT association proposed to describe the process of cells undergoing intermediate E/M fenotypic states as epitel-mesenchymal plasticity (EMP)26. Denne plastisiteten refererer til delvis EMT, en hybrid E/M-status, en metastable EMT-tilstand, et EMT-kontinuum og etEMT-spektrum 26. Under EMT får tumorceller kreftstamcelleegenskaper (CSC) og blir mer motstandsdyktige mot løsrivelsesindusert apoptose27. Mens EMT er ansvarlig for oppkjøpet av en invasiv fenotype i primære tumorceller og driver kreftprogresjon, har mesenchymal-epitelovergang (MET) vist seg å spille en viktig rolle i utveksten av spredte tumorceller på fjerne metastatiskesteder 28,29. En fersk studie viste at EMT-avledede brystkreftceller kan transdifferentiated i adipocytter, som kan gi en mulighet til å hemme metastase og overvinne terapi motstand i tumorceller og tilbakefall kreft30. På grunn av den viktige rollen TGF-β signalisering i aktivering av EMT i brystkarsinogenese, vi presenterer detaljerte protokoller for vestlig blotting, en luciferase transkripsjonsreporter analyse, kvantitativ sanntid-polymerase kjedereaksjon (qRT-PCR), og immunofluorescens for undersøkelse av TGF-β signalering, TGF-β-indusert EMT, og transdifferentiation av EMT-avledede murine bryst epiteltumtumceller i adipocytter. Disse teknikkene er de mest brukte analytiske verktøyene i cellebiologifeltet. qRT-PCR brukes til å oppdage, karakterisere og kvantifisere mRNA-uttrykksnivåer på en kvantitativ måte. Sammenlignet med kvantitativ PCR (qPCR), en alternativ teknikk, kan omvendt transkripsjon (RT)-PCR brukes til å bestemme mRNA-uttrykk på en semi-kvantitativmåte 31,32. Vestlig blotting brukes til å undersøke spesifikke proteinnivåer i en gitt cellelylatprøve med fordeler av følsomhet og spesifisitet, på en semi-kvantitativ måte. Dermed presenterer vi en systematisk arbeidsflyt for å analysere endringer fra genuttrykk til proteinuttrykk for å undersøke TGF-β-signalering som også kan brukes på andre signalveier.

Protocol

1. Analyse av TGF-β-indusert SMAD2 fosforylering ved hjelp av vestlig blotting

MERK: Premalignant human breast MCF10A-Ras celler ble brukt som et eksempel for å undersøke TGF-βsignalresponser 33. I prinsippet gjelder metodene som er beskrevet nedenfor også for andre TGF-β-responsive cellelinjer.

  1. Kultur bryst epitelcellelinjen MCF10A-Ras ved 37 ° C i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) / F12 som inneholder L-glutamin med 5% hest serum, 20 ng/ml epidermal vekstfaktor (EGF), 10 mg/ml insulin, 100 ng/ml kolera enterotoksin, 0,5 mg/ml hydrokortison og 1:100 penicillin-streptomycin (Pen-Strep).
  2. Trypsinize MCF10A-Ras celler med 1 ml på 0,25% trypsin-EDTA i 1 minutt og telle levedyktige celler ved hjelp av en celleteller.
  3. Frøceller i 6-brønnsplater med en tetthet på 5×105 celler / brønn.
  4. Etter vekst over natten, behandle celler med enten TGF-β (5 ng / ml) eller ligand buffer (4 mM HCl, 0,1% fett-syre-fri storfe serum albumin (BSA)) i 1 time, og deretter fjerne kultur medium og forsiktig vaske cellene to ganger med 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS).
  5. Kule celler i 6-brønns plater på is og tilsett 150 μL av precooled radio immun nedbør analyse (RIPA) lysis buffer (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% natrium deoxycholate, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, og nylaget mini protease inhibitor cocktail). La lysis fortsette på is i 10 minutter.
  6. Skrap tilhengerceller av parabolen ved hjelp av en plastcelleskraper, og overfør deretter forsiktig cellesuspensjonen til et forkjølet mikrocentrifugerør.
  7. Sentrifuger cellelysatet i 10 minutter ved 150 sentrifugalkraft (x g) ved 4 °C og overfør supernatanten til et friskt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  8. Mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av et vaskemiddelkompatibelt (DC) proteinanalysesett.
  9. Legg 30 μg protein fra hver prøve på en 10% natrium dodecylsulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) gel og kjøre gelen med en spenning på 100 V i 1,5-2 timer.
  10. Overfør proteinene fra gelen til en 45-μm polyvinylidendifluorid (PVDF) membran med en spenning på 110 V i 1-1,5 timer.
  11. Overfør PVDF-membranen til en passende beholder med proteinsiden (siden som vendte gelen) opp, og skyll membranen kort i destillert vann.
  12. Kast vannet, tilsett Ponceau S-oppløsning, og sett membranen på en gyngeplattform i 1-2 minutter.
  13. De-flekk membranen med destillert vann ved raskt å skylle den og deretter vaske den i 1 minutt.
  14. Deretter legger du PVDF-membranen på en lysboks, og tar et bilde for å se etter like totale proteinbelastninger.
  15. Vask membranen med Tris-bufret saltvann med Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl og 0,1% Tween 20) til det ikke er synlig farging.
  16. Sett membranen i blokkeringsbuffer (5% skummet melk i TBST-løsning) og inkuber den i 1 time ved romtemperatur.
  17. Vask membranen to ganger med TBST.
  18. Inkuber membranen med primære antistoffer mot fosfo-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, hjemmelaget 34),totalt SMAD2/3 1:1000 og glyseraldehyd 3-fosfatdehydrogenase (GAPDH; 1:1000), over natten ved 4 °C.
  19. Vask membranen to ganger med TBST og inkuber membranen med et sekundært antistoff mot kanin eller mus (1:5000) i 2 timer.
  20. Inkuber PVDF-membranen med Western ECL-substrat i 30 sekunder, og oppdag signalet ved hjelp av et bildesystem.
  21. Gjenta eksperimentene minst tre ganger for å få biologiske triplicates.

2. Analyse av TGF-β-induserte SMAD3-avhengige transkripsjonssvar

  1. Utfør SMAD3/SMAD4-avhengige CAGA12-luciferase transkripsjonsreporteranalyse.
    1. Kultur og trypsinize MCF10A-Ras celler som beskrevet i trinn 1. Frøceller i 24-brønnsplater ved 5×104 celler / godt og la cellene holde seg over natten.
    2. Dagen etter såing, cotransfect cellene i hver brønn med 100 ng av TGF-β/SMAD3-induserbar (CAGA)12 luciferase transkripsjonsreporter konstruere35 og 80 ng av β-galaktosidase uttrykk konstruere ved hjelp av polyetylenenimin (PEI). Transfiseringen av β-galaktosidase brukes til å normalisere forskjeller i transinfeksjonseffektivitet mellom ulike brønner. Sett opp hver eksperimentell gruppe i triplicate.
    3. Etter 24 timers inkubasjon, sulteceller med serumfri DMEM-høy glukose og, 6 timer senere, legge TGF-β (5 ng / ml) eller ligand buffer (4 mM HCl, 0,1% BSA) som en kjøretøykontroll til cellene.
    4. Etter ytterligere 24 timers inkubasjon, vask celler to ganger med forhåndswarmed PBS.
    5. Tilsett 120 μL/brønn 1× lysisbuffer og rist forsiktig platen ved 4 °C i 20 minutter.
    6. Overfør 30 μL lysat til hver brønn av en 96-brønns hvit analysemikroplate for å måle luciferaseaktivitet ved hjelp av et luminometer.
    7. Overfør 50 μL lysat til hver brønn av en 96-brønns gjennomsiktig plate for å måle β-galaktosidaseaktivitet.
    8. Normaliser luciferaseaktiviteten til β-galaktosidaseaktiviteten og gjenta eksperimentene minst tre ganger for å oppnå biologiske triplicates.
  2. Analyser uttrykket for TGF-β målgener ved hjelp av kvantitativ sanntidspolymerasekjedereaksjon (qRT-PCR).
    1. Kultur og trypsinize MCF10A-Ras celler som beskrevet i trinn 1. Frøceller i 6-brønnsplater ved 5×105 celler / brønn og la cellene holde seg over natten.
    2. Behandle celler med TGF-β (5 ng/ml) eller ligand buffer (4 mM HCl, 0,1% BSA) i 6 timer, og vask deretter cellene to ganger med 1 ml PBS.
    3. Isoler total RNA ved hjelp av et RNA-isolasjonssett.
    4. Bestem RNA-konsentrasjonen med en NanoDrop og utfør cDNA-syntese med 1 μg RNA ved hjelp av et første tråd-cDNA-syntesesett.
    5. Bruk et sanntids-PCR-deteksjonssystem til å utføre kvantitative sanntids-PCR (qRT-PCR) med ti ganger fortynnet cDNA i en 10 μL reaksjonsblanding som inkluderer spesifikke menneskelige fremover- og omvendt primere for GAPDH (for normalisering), SERPINE1 (koding av PAI-1-proteinet, et TGF-β/SMAD-målgen), SMAD7 (TGF-β/SMAD-målgen) og qPCR Master Mix. Sett opp hver eksperimentell gruppe i triplicate.
      MERK: Primersekvensene som brukes til å oppdage målde menneskers gener i qRT-PCR, er oppført i tabell 1.
    6. Bruk følgende qPCR reaksjonsforhold: initialisering, 95 °C i 3 minutter; denmetning, 95 °C i 10 sekunder; annealing, 60 °C i 30 sekunder; og forlengelse, 80 °C i 10 sekunder; denning, glødende og forlengelse gjentas 40 ganger.
    7. Gjenta eksperimentene minst tre ganger for å få biologiske triplicates.

3. Analyse av TGF-β-indusert EMT

  1. Analyser uttrykket av EMT-markører på proteinnivået ved hjelp av vestlig blotting.
    MERK: Analysen av TGF-β-indusert EMT vises ved hjelp av mus NMuMG epitelceller som eteksempel 36,37.
    1. Kultur NMuMG celler ved 37 °C i DMEM-høyt glukosemedium supplert med 10% føtal storfe serum og 1:100 Pen-Strep. Bruk metoder som er beskrevet i trinn 1 for proteinisolering og deteksjon.
      MERK: Følgende antistoffer brukes i dette eksperimentet: E-cadherin, 1:1000; N-cadherin, 01:1000; Sneglen, 1:1000; Slug, 01:1000; Tubulin, 1:1000 (Figur 3).
  2. Analyser uttrykket for EMT-markører på mRNA-nivå ved hjelp av kvantitativ sanntids-PCR som beskrevet i trinn 2.2.
    MERK: Alle muset primere som brukes til qRT-PCR, inkludert CDH1 (koding av E-kadherinproteinet), SNAILog ZEB2 (figur 3) er oppført i tabell 1.
  3. Analyser EMT-prosessen ved hjelp av indirekte immunofluorescens og direkte fluorescensfarging.
    1. Indirekte immunofluorescence farging av E-kadherin
      1. Plasser sterile 18 mm-side firkantede glassdeksler i 6-brønns plater (en dekkslipp per brønn).
      2. Seed 1×105 NMuMG celler med 2 ml komplett DMEM per 6-brønnsplate og la cellene holde seg over natten.
      3. Flytt forsiktig dekkslipsene med tilhengerceller til en ny 6-brønnsplate og tilsett 2 ml kulturmedium til brønnene.
      4. Behandle cellene med TGF-β (5 ng/ml) eller ligand buffer (4 mM HCl, 0,1% BSA) i 2 dager.
      5. Fjern kulturmediet og vask forsiktig cellene to ganger med 1 ml forhåndsvarmt PBS.
      6. Fest cellene ved å legge til 1 ml 4% paraformaldehyd og inkubere i 30 minutter ved romtemperatur. Vask deretter forsiktig cellene to ganger med 1 ml PBS.
      7. Gjennomsyre de faste cellene med 0,1% Triton X-100 i 10 minutter ved romtemperatur og vask cellene to ganger med PBS.
      8. Blokker cellene med 5% BSA i PBS i 1 time ved romtemperatur og vask cellene to ganger med PBS.
      9. Tilsett det primære antistoffet mot E-kadherin (fortynnet 1:1000 i PBS) på toppen av hver dekkslips og inkuber i 1 time ved romtemperatur.
      10. Fjern det primære antistoffet og vask dekkslippen med PBS tre ganger.
      11. Tilsett Alexa Fluor 555 sekundært antistoff (fortynnet 1:500 i PBS) til toppen av hver dekkslips og inkuber i 1 time ved romtemperatur mens du dekker med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys.
      12. Fjern det sekundære antistoffet og vask dekkglasset med PBS tre ganger.
      13. Monter dekkslippen (celler vendt nedover) på glasssklier ved hjelp av monteringsmedium med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) og oppbevar de monterte lysbildene i en boks ved 4 °C, beskyttet mot lys.
      14. Vær oppmerksom på farging med SP8-konfokal mikroskopi.
    2. Direkte fluorescens farging av filamentøs (F)-actin.
      1. Klargjøre prøver følgende trinn 3.3.1.1. til 3.3.1.9.
      2. Beis cellene ved å legge alexa fluor 488 falloidin (1:1000) i 1 time ved romtemperatur i mørket for å visualisere filamentøs actin (F-actin).
      3. Vask celler tre ganger med PBS.
      4. Monter dekkglasset på glasssklier ved hjelp av monteringsmedium med DAPI og ta bilder med SP8-mikrokopi.

Representative Results

Analyse av TGF-β signalisering
Det viktigste trinnet i TGF-β signalering er fosforylering av de to mest karboksy terminal serine rester i SSXS motiv (Figur 2) av TβRI kinase38,39. For å undersøke TGF-β signalresponser utførte vi vestlig blotting av fosforylert SMAD2. I de premalignant humane bryst MCF10A-Ras celler, fosforylering av SMAD2 betydelig økt som svar på TGF-β stimulering i 1 time, mens uttrykket for total SMAD2/3 ikke ble påvirket av TGF-β behandling (Figur 4A). Ved å bruke TGF-β-indusert SMAD3/4-drevet CAGA-luc transkripsjons reporter analyse, fant vi at TGF-β markert indusert luciferase reporter i MCF10A-Ras celler linje sammenlignet med ikke-behandlede celler (Figur 4B). Videre observerte vi at godt karakteriserte direkte transkripsjonsgenmål for TGF-β inkludert SMAD7 og SERPINE1 (koding av PAI-1-proteinet), var sterkt uttrykt i TGF-β-behandlede MCF10A-Ras-celler (figur 4C).

Analyse av TGF-β-indusert EMT
Vi vurderte TGF-β-indusert EMT med ulike metoder, for eksempel morfologiske endringer, uttrykk for EMT-markører ved mRNA- og proteinnivåene og immunofluorescencefarging av EMT-markører36. NMuMG epitelceller behandlet med TGF-β i 1 og 2 dager endret fra en klassisk epitelmorfologi til en spindelformet mesenchymal-lignende morfologi, som vist ved fasekontrastmikroskopi (figur 5A). I samsvar med de morfologiske endringene observerte vi at TGF-β behandling førte til en økning i proteinuttrykket av mesenchymale markører, inkludert N-cadherin, Snegl og Slug37 (figur 5B). I motsetning, E-kadherin, en epitelmarkør, ble nedregulert i NMuMG celler etter 2 dager med TGF-β behandling (Figur 5B). I tillegg utførte vi kvantitativ sanntidpolymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) for å undersøke genuttrykket til EMT-markører. CDH1 (koding av E-kadherinproteinet) ble betydelig redusert, mens mesenchymale markører som SNAIL og Sinkfinger E-boksbindende homeoboks 2 (ZEB2) ble markert økt etter TGF-β stimulering i NMuMG-celler sammenlignet med ubehandlede celler (figur 5C). TGF-β-indusert EMT i NMuMG celler ble ytterligere bekreftet ved immunofluorescence farging av E-kadherin. Ved TGF-β stimulering i 2 dager uttrykte NMuMG-celler mindre E-kadherin enn celler i den uinduserte kontrollgruppen, som analysert av konfokal mikroskopi (figur 5D). Videre NMuMG celler i nærvær av TGF-β dannet mer actin stress fibre, som vist ved konfokal mikroskopi (Figur 5E).

SB431542 og GW788388 hemmer TGF-β signalsignal og TGF-β-indusert EMT
SB431542 er en ATP konkurransedyktig hemmer av kinase domenet tβri, også be begreper activin reseptor-lignende kinase 5 (ALK5), mens GW788388 hemmer TβRI og TβRII kinase aktivitet. Begge hemmere kan hemme TGF-β reseptor signalering40. Dermed behandlet vi NMuMG-celler med forskjellige konsentrasjoner av GW788388 i nærvær av TGF-β i 1 time. Som forventet hemmet GW788388 TGF-β-indusert SMAD2 fosforylering på en doseavhengig måte (figur 6A). I tillegg ble TGF-β-mediert fosforylering av SMAD2 blokkert av SB431542 behandling (figur 6A). Fosforylert SMAD2/3 danner et heteromerisk kompleks med SMAD4 og translocates inn i kjernen for å modulere transkripsjonen av målgener. Derfor undersøkte vi translokasjonen av SMAD2/3 i NMuMG-celler ved immunofluorescencefarging av SMAD2/3. Dataene viste at både SB431542 og GW788388 signifikant hemmet TGF-β-indusert kjernefysisk translokasjon og akkumulering av SMAD2/3 i NMuMG-celler (figur 6B). Videre ble de hemmende effektene av SB431542 og GW788388 også observert i mRNA-uttrykksnivåene til viktige TGF-β-målgener involvert i EMT, inkludert PAI-1, SNAIL, E-kadherin og Fibronectin (figur 6C). Disse dataene antydet at SB431542 og GW788388 blokkert TGF-β signalisering og TGF-β-indusert EMT.

Analyse av transdifferentiation av mesenchymale brystkreftceller i adipocytter
EMT spiller en viktig rolle i å forbedre cellulær plastisitet i kreft og resulterer i utvikling av terapiresistens. Kreftcelleplastisitet kan være direkte målrettet og hemmet med en transdiensisjonstilnærming, for eksempel tvungen adipogenese30. Vi brukte Py2T murine brystkreftceller, som var avledet fra brystkjertelen av en mus mammary tumor virus-polyoma midtsvuls-antigen (MMTV-PyMT) transgen mus, som en cellulær modell av EMT-indusert kreftcelleplastisitet. Basert på en etablertprotokoll 41,behandlet vi EMT-avledet Py2T murine brystkreftceller med anti-diabetisk legemiddel rosiglitazon i 10 dager for å indusere adipogenese. Adipogenese ble vurdert ved å visualisere lipiddråper ved hjelp av oljerød O-farging. Fettceller ble lett oppdaget i rosiglitazon-behandlede Py2T murine brystkreftceller (figur 7), som viste at behandling med rosiglitazon alene er tilstrekkelig til å fremme transdifferentiation av EMT-avledede brystkreftceller i adipocytter.

Figure 1
Figur 1: TGF-β/SMAD-signalering. TGF-β signalisering initierer med bindingen av TGF-β til TGF-β type II reseptor (TβRII), en konstituerende aktiv kinase, at fosforyler TGF-β type I reseptor (TβRI). Deretter aktiveres TβRI kinasefosforyler SMAD2/3. Et peptid som inneholder SSXS-motivet til SMAD2 med to karboksy terminalfosforylert serinrester ble brukt til å oppnå polyklonale antisera som gjenkjenner fosfor-SMAD2 (p-SMAD2). Derfor kan analysen av p-SMAD2 uttrykk ved vestlig blotting brukes til å bestemme aktiveringen av TGF-β signalveien. Fosforylert SMAD2/3 kan danne heteromeriske komplekser med SMAD4, som deretter translocate inn i kjernen for å modulere transkripsjonelle svar. CAGA12-luciferase reporter analyse og kvantitativ sanntid PCR (qRT-PCR) for mRNA uttrykk for TGF-β mål gener som SMAD7 og SERPINE1 (koding PAI-1 protein), kan brukes til å analysere TGF-β-indusert SMAD3-avhengige transkripsjonsresponser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk struktur av R-SMADs (SMAD2 og SMAD3). MH1-domenene MH1 (blå) og MH2 (gul) bevares blant R-SMADer, men koblingsområdet (grå) bevares ikke. MH1-domenet til SMAD3 har et DNA-bindende motiv, mens SMAD2 ikke direkte kan binde DNA, på grunn av en innsetting (exon 3) i MH1-domenet. MH2-domenet formidler SMAD oligomerisering, interaksjon med TGF-β reseptorer, og proteinbinding og er involvert i transkripsjonsregulering. SMAD2 og SMAD3 kan aktiveres ved fosforylering av SSXS-motivet (i rødt) i deres C termini. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: TGF-β-indusert EMT. Under TGF-β-indusert epitel-mesenchymal overgang (EMT), cellene gjennomgår tap av epitel og oppkjøp av mesenchymale egenskaper med forbedret cellemotilitet og invasjon evne. Induksjonen av EMT fører til uttrykk for mesenchymale markører som N-cadherin, Zeb2 og Snail1/2, samt nedregulering av epitelmarkører, inkludert E-kadherin, β-catenin og claudin-1. Det akkumulerte tapet eller gevinsten av epitel/mesenchymale (E/M) egenskaper fører til at en celle går inn i mellomliggende tilstander på en reversibel måte. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: TGF-β signalresponser i MCF10A-Ras-celler. (A)MCF10A-Ras-celler ble behandlet enten med eller uten TGF-β (2,5 ng/ml) i 1 time, og cellelylater ble immunoblottert for fosforylert SMAD2 (p-SMAD2), total SMAD2/3 og GAPDH (som lastekontroll). Størrelsesmarkøren vises til høyre. Con: Kontrollgruppe uten TGF-β behandling. (B) Analyse av TGF-β (5 ng/ml) aktivitet ved hjelp av SMAD3-SMAD4-avhengige CAGA12-luciferase (LUC) transkripsjonsreporter i MCF10A-Ras celler. Verdiene normaliseres til β-galaktosidase (βGal) aktivitet. Data uttrykkes som gjennomsnittet ± s.d, n = 3. Studentens t test, *** P ≤ 0,001 (C) qRT-PCR analyse av TGF-β mål gener SMAD7 og SERPINE1 (koding PAI-1 protein) i MCF10A-Ras celler behandlet med TGF-β (2,5 ng / ml) i 6 timer. GAPDH ble brukt som en intern kontroll. Data uttrykkes som gjennomsnittet ± s.d, n = 3. Studentens t test, *** P ≤ 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: TGF-β-indusert EMT i NMuMG-celler. (A) Morfologi av NMuMG-celler behandlet med TGF-β (2,5 ng/ml) i 1 eller 2 dager. I nærvær av TGF-β, NMuMG celler transdifferentiated til en mesenchymal fenotype. Vektstangen = 150 μm (B) NMuMG-celler ble behandlet med eller uten TGF-β (5 ng/ml) i 2 dager, og EMT-markører ble analysert av vestlig blotting. Størrelsesmarkøren er som angitt til høyre. Con: Kontrollgruppe uten TGF-β behandling. (C) Genuttrykksanalyse av EMT-markører (CDH1 (koding av E-kadherinprotein), SNAIL og ZEB2) i NMuMG-celler behandlet i 2 dager med TGF-β (5 ng/ml). GAPDH ble brukt som en intern kontroll. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet ± s.d., n = 3. Studentens t-test, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001. (D) NMuMG-celler ble farget av immunofluorescence for å oppdage uttrykket av epitelmarkøren E-kadherin (rød) etter behandling med TGF-β (2,5 ng/ml) i 2 dager. Nuclei ble motarbeidet med DAPI (blå). Bilder ble tatt med konfokal mikroskopi. Vektstangen = 50 μm (E) NMuMG-celler ble farget med fluorescein-falloidin (grønn) for å visualisere F-actin. Nuclei ble motarbeidet med DAPI (blå). Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: TGF-βsignaling og TGF-β-indusert EMT ble hemmet av SB431542 og GW788388. (A) NMuMG-celler ble behandlet med 10 μM SB431542 (SB) eller de angitte konsentrasjonene av GW788388 (GW) i nærvær eller fravær av TGF-β (5 ng/ml) i 1 time. Cellelylatene ble immunoblotted for p-SMAD2, SMAD2/3 og GAPDH. (B) NMuMG-celler ble behandlet med 5 μM SB431542 (SB) eller 10 μM GW788388 (GW) i nærvær eller fravær av 5 ng/ml TGF-β i 1 time og farget av immunofluorescence for å oppdage atomtranslokasjon av SMAD2/3 (grønn). Bilder ble tatt med konfokal mikroskopi. (C) Uttrykk for TGF-β mål gener, inkludert PAI-1 og gener koding EMT markører, inkludert SNAIL, E-Cadherin og Fibronectin, ble analysert ved omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) i NMuMG celler etter SB eller GW behandling og TGF-β stimulering i 48 timer. GAPDH fungerte som en lastekontroll. Kontroll betegner ubehandlede celler. Dette tallet er endret fra Petersen M. et al. 34 med tillatelse fra utgiver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: EMT-avledede Py2T murine brystkreftceller kan induseres til å differensiere til adipocytter. Py2T murine brystkreftceller ble stimulert med 2 ng/ml TGF-β i 20 dager for å indusere fullstendig EMT. Deretter ble cellene behandlet enten med DMSO som en kjøretøykontroll eller rosiglitazon (2 μM) i 10 dager for å tillate differensiering av mesenchymale kreftceller og indusere adipogenese. Mediet ble endret annenhver dag. Etter 10 dagers behandling ble cellene farget med oljerød O. Skalalinje = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Arter Gennavn Fremover (5' til 3') Omvendt (5' til 3')
Menneskelige GAPDH TGCACCACCAACTGCTTAGC LEILIGHET GGCATGGACTGTGGTCATGAG
SMAD7 TCCAGATGCTGTGCCTTCC GTCCGAATTGAGCTGTCCG
SERPINE1 CACAAATCAGACGGCAGCACT LEILIGHET CATCGGGCGTGGTGAACTC
Mus (mus) GAPDH TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC LEILIGHET AAGATGGTGATGGGCTTCCCG
CdH1 Leilighet AAAAAGTGACGCTGAAGTC GAGGATGTACTTGGCAATGG
Sneglen CAGCTGGCCAGGCTCTCGGT GCGAGGGCCTCCGGAGCA
Zeb2 TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC TTCTGGCCCCATTGCATCAT

Tabell 1: Primere som brukes til qRT-PCR.

Discussion

TGF-β/SMAD-signalering spiller en avgjørende rolle i brystkreftprogresjon, da det kan fremme brystkreftcelleinvasivitet og metastase ved å indusere EMT7. Her beskrev vi en logisk arbeidsflyt for å undersøke TGF-β-initiert signalisering fra reseptorindusert SMAD-aktivering til SMAD-medierte transkripsjons- og biologiske responser. Vi startet med å beskrive analysen av SMAD2 fosforylering, fortsatte med TGF-β-indusert SMAD3-avhengige transkripsjonsresponser og EMT-markøruttrykk på både gen- og proteinnivåene for å analysere TGF-β/SMAD-signalresponsen, og til slutt undersøkte TGF-β-indusert EMT. Vi brukte CAGA12-luciferase transkripsjonsreporter som inneholder CAGA-bokser avledet fra PAI-1-arrangøren, til å overvåke aktiviteten til TGF-β/ SMAD-signalveien35. Denne reporterkonstruksjonen krever SMAD3 og SMAD4 for aktivering. Tidligere studier har vist at knockdown av SMAD4 dempet TGF-β-indusert CAGA12-luciferase aktivitet37. I tillegg til reporteranalysen, bestemme fosforylering status for endogene SMADs, inkludert SMAD2 og SMAD3, er en annen måte å undersøke TGF-β signalrespons. Faktisk, andre medlemmer av TGF-β familien, som vekst og differensiering faktor (GDF)-8/myostatin og GDF-9, også transdusere signaler via SMAD2/3 proteiner ved å engasjere TβRI42,43,44. I tillegg til CAGA12-luciferase reporter, flere lignende journalister har blitt brukt til å oppdage aktivering av TGF-β signalisering. For eksempel kan en transkripsjons (SBE)4-Lux-reporter med svarelementer avledet fra JunB-arrangøren effektivt induseres av TGF-β, activins og BMPs45.

Vestlig blotting og qPCR ble brukt til å analysere TGF-β-indusert EMT, som er klassiske metoder for å undersøke uttrykket av epitelmarkører (det vil si E-kadherin) og mesenchymale markører (det vil si N-kadherin, Snail, Slug og Zeb2). Vi utførte også indirekte immunofluorescensfarging av E-kaderin og direkte fluorescensfarging av F-actin. Disse analysene validerte videre mesenchymal fenotype av celler etter TGF-β behandling. Begrensningen av immunofluorescence farging er at cellene må fikses før inkubasjon med antistoffer og bildebehandling, og det er vanskelig å undersøke endringer i EMT markør uttrykk i levende celler. Nylig har utformingen av EMT reporter cellelinjer, for eksempel A549 lunge adenokarsinom-vimentin-RFP, gjort det mulig å overvåke transformasjonen av epitelceller til mesenchymale celler i sanntid via uttrykk for rødt fluorescerende protein (RFP)-merket vimentin. Denne plattformen kan benyttes til narkotikascreening og ny narkotikautvikling46. LifeAct fargestoff, en 17-amino-syre peptid, som kan flekke F-actin strukturer i levende celler, blir et verdifullt verktøy for å visualisere actin cytoskeleton i sanntid uten å forstyrre cellulæreprosesser 47. I denne studien brukte vi to småmolekylhemmere, SB431542 og GW788388, for å validere deres hemmende effekt på TGF-β-signalering og TGF-β-indusert EMT. Spesielt, GW788388 sterkt hemmer TβRI og TβRII aktivitet, mens SB431542 har en hemmende effekt på bare TβRI (og ALK4 og ALK7). Tidligere studier viste at GW788388 er mer potent in vivo enn SB43154240. I tillegg til hemming av EMT reduserte GW788388 uttrykket for fibrosemarkører i nyrene, og oral administrering av GW788388 hos diabetiske mus reduserte markert glomerulopati25,48.

EMT spiller en viktig rolle i å fremme kreftcelleplastisitet og resulterer i legemiddelresistens og metastase 49. Derfor, rettet mot EMT-avledede celler med spesifikke cytotoksiskelegemidler 50 eller induserer redifferentiation via mesenchymal-til-epitelovergang (MET)51 har blitt foreslått som en tilnærming til å overvinne kreftcellemetastase og behandlingsresistens. MET bidrar imidlertid til spredning av spredte kreftceller i fjerne organer52, som kan være kontraproduktiv når du bruker terapeutisk reversjon av EMT. Nylig rapporterte en ny studie en terapeutisk transdifferentiation tilnærming ved direkte målretting EMT-avledede brystkreftceller for differensiering i adipocytter30. Studien av Ishay-Ronen et. al.30 brukte Py2T murine epitelkreftceller som hadde gjennomgått en overgang til mesenchymale celler som svar på langvarig behandling med TGF-β. De viste at rosiglitazon i kombinasjon med MEK-hemmere forbedret epiteldilatering og adipogenese. Vi fant imidlertid at rosiglitazon alene var tilstrekkelig til å indusere transdifferentiation av mesenchymal Py2T murine celler i adipocytter.

Oppsummert ga metodene som brukes i denne studien en logisk arbeidsflyt for å undersøke TGF-β-signalering og TGF-β-indusert EMT. De to hemmerne, SB431542 og GW788388, kan blokkere TGF-β-induserte responser og EMT. I tillegg viste vi også rosiglitazon alene induserer adipogenese i visse TGF-β-induserte mesenchymale brystkreftceller. Selv om vi brukte bare flere brystkreftcellelinjer for å undersøke TGF-β svar, metodene beskrevet her kan ekstrapoleres til andre (kreft) celler. Her brukte vi ulike TGF-β konsentrasjoner for å indusere cellulære responser. I de fleste celletyper utøver TGF-β sin biologiske aktivitet i konsentrasjonsområdet 0,01-10 ng/ml53 og induserer signalering i et doseresponsmønster. I primære endotelceller, inkludert storfe aorta endotelceller, TGF-β indusert det betydelige uttrykket av fosforylert SMAD2 på 0,025 ng / ml, nådde maksimalt på 0,25 ng / ml, og forble på dette nivået som svarpå høyere konsentrasjoner 53. I vår studie brukte vi en høy konsentrasjon av TGF-β (5 ng/ml) i MCF10A-Ras-celler for transkripsjonsreporteranalysen for å oppnå sterke svar. SMAD2 fosforylering og målgenuttrykk kan induseres av TGF-β ved en lav dose; Dermed brukte vi 2,5 ng/ml TGF-β til å behandle celler. Imidlertid avhenger den mest passende arbeidskonsentrasjonen av celletypen og estimerte effekter. For å bestemme den beste konsentrasjonen av TGF-β, behandle cellene med forskjellige doser (fra lav til høy) anbefales.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi anerkjenner støtte fra det kinesiske stipendrådet (CSC) til J.Z. og Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC. NL) til P.t.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
18 mm-side square glass coverslips Menzel Gläser 631-1331
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories H-1200
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 555 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21422
Anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody Merck Millipore MAB374
Anti-N-cadherin antibody BD Biosciences 610920
Anti-Slug antibody Cell Signaling Technology 9585
anti-SMAD2/3 antibody Becton Dickinson 610842
Anti-Snail antibody Cell Signaling Technology 3879
Anti-Tubulin antibody Cell Signaling Technology 2148
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Cholera enterotoxin Sigma-Aldrich C8052
Clarity Western ECL Substrate Bio-Rad 1705060
DC protein assay kit Bio-Rad 5000111
DMEM-high glucose Thermo Fisher Scientific 11965092
DMEM-high glucose medium Thermo Fisher Scientific 11965092
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12 Thermo Fisher Scientific 11039047
epidermal growth factor (EGF) Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum (FBS) BioWest S1860-500
GoTaq qPCR Master Mix PROMEGA A600X
Horse serum Thermo Fisher Scientific 26050088
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135
Insulin Sigma-Aldrich 91077C
Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
NucleoSpin RNA II kit BIOKE´ 740955
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Thermo Fisher Scientific 15140148
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck Millipore IPVH00010
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific K1621
Rosiglitazone Sigma-Aldrich 557366-M
Skimmed milk Campina: Elk
Equipment
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad 17001402
CFX Connect Detection System Bio-Rad 1855201
Luminometer Perkin Elmer 2030-0050
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tzavlaki, K., Moustakas, A. TGF-β Signaling. Biomolecules. 10 (3), (2020).
  2. Hao, Y., Baker, D., Ten Dijke, P. TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Cancer Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), (2019).
  3. Morikawa, M., Derynck, R., Miyazono, K. TGF-β and the TGF-β Family: Context-Dependent Roles in Cell and Tissue Physiology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), (2016).
  4. Derynck, R., Akhurst, R. J. Differentiation plasticity regulated by TGF-β family proteins in development and disease. Nature Cell Biology. 9 (9), 1000-1004 (2007).
  5. Massague, J. How cells read TGF-β signals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (3), 169-178 (2000).
  6. Seoane, J., Gomis, R. R. TGF-β Family Signaling in Tumor Suppression and Cancer Progression. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (12), (2017).
  7. Colak, S., Ten Dijke, P. Targeting TGF-β Signaling in Cancer. Trends in Cancer. 3 (1), 56-71 (2017).
  8. Suriyamurthy, S., Baker, D., ten Dijke, P., Iyengar, P. V. Epigenetic Reprogramming of TGF-β Signaling in Breast Cancer. Cancers (Basel). 11 (5), (2019).
  9. Drabsch, Y., Ten Dijke, P. TGF-β signalling and its role in cancer progression and metastasis). Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3-4), 553-568 (2012).
  10. Goumans, M. J., Ten Dijke, P. TGF-β Signaling in Control of Cardiovascular Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), (2018).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-β and TGF-β-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), (2016).
  12. Robertson, I. B., et al. Latent TGF-β-binding proteins. Matrix Biology. 47, 44-53 (2015).
  13. Khan, Z., Marshall, J. F. The role of integrins in TGF-β activation in the tumour stroma. Cell and Tissue Research. 365 (3), 657-673 (2016).
  14. Jenkins, G. The role of proteases in transforming growth factor-β activation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1068-1078 (2008).
  15. Tran, D. Q., et al. GARP (LRRC32) is essential for the surface expression of latent TGF-β on platelets and activated FOXP3+ regulatory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13445-13450 (2009).
  16. Stockis, J., Colau, D., Coulie, P. G., Lucas, S. Membrane protein GARP is a receptor for latent TGF-β on the surface of activated human Treg. European Journal of Immunology. 39 (12), 3315-3322 (2009).
  17. Wang, R., et al. GARP regulates the bioavailability and activation of TGF-β. Molecular Biology of the Cell. 23 (6), 1129-1139 (2012).
  18. Vander Ark, A., Cao, J., Li, X. TGF-β receptors: In and beyond TGF-β signaling. Cellular Signalling. 52, 112-120 (2018).
  19. Heldin, C. H., Miyazono, K., ten Dijke, P. TGF-β signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature. 390 (6659), 465-471 (1997).
  20. ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signalling. Trends in Biochemical Sciences. 29 (5), 265-273 (2004).
  21. Miyazono, K. TGF-β signaling by Smad proteins. Cytokine & Growth Factor Reviews. 11 (1-2), 15-22 (2000).
  22. Yu, Y., Feng, X. H. TGF-β signaling in cell fate control and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 61, 56-63 (2019).
  23. Zhang, Y. E. Non-Smad pathways in TGF-β signaling. Cell Research. 19 (1), 128-139 (2009).
  24. Katsuno, Y., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-β signaling and epithelial-mesenchymal transition in cancer progression. Current Opinion in Oncology. 25 (1), 76-84 (2013).
  25. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (3), 178-196 (2014).
  26. Yang, J., et al. Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 341-352 (2020).
  27. Zhang, Y., Weinberg, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition in cancer: complexity and opportunities. Frontiers in Medicine. 12 (4), 361-373 (2018).
  28. Brabletz, T., Kalluri, R., Nieto, M. A., Weinberg, R. A. EMT in cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (2), 128-134 (2018).
  29. Ocana, O. H., et al. Metastatic colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal transition inducer Prrx1. Cancer Cell. 22 (6), 709-724 (2012).
  30. Ishay-Ronen, D., et al. Gain Fat-Lose Metastasis: Converting Invasive Breast Cancer Cells into Adipocytes Inhibits Cancer Metastasis. Cancer Cell. 35 (1), 17-32 (2019).
  31. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiology Ecology. 67 (1), 6-20 (2009).
  32. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  33. Sundqvist, A., et al. JUNB governs a feed-forward network of TGF-β signaling that aggravates breast cancer invasion. Nucleic Acids Research. 46 (3), 1180-1195 (2018).
  34. Persson, U., et al. The L45 loop in type I receptors for TGF-β family members is a critical determinant in specifying Smad isoform activation. FEBS Letters. 434 (1-2), 83-87 (1998).
  35. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF-β-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. The EMBO Journal. 17 (11), 3091-3100 (1998).
  36. Piek, E., Moustakas, A., Kurisaki, A., Heldin, C. H., ten Dijke, P. TGF-β type I receptor/ALK-5 and Smad proteins mediate epithelial to mesenchymal transdifferentiation in NMuMG breast epithelial cells. Journal of Cell Science. 112, Pt 24 4557-4568 (1999).
  37. Deckers, M., et al. The tumor suppressor Smad4 is required for transforming growth factor-β-induced epithelial to mesenchymal transition and bone metastasis of breast cancer cells. Cancer Research. 66 (4), 2202-2209 (2006).
  38. Souchelnytskyi, S., et al. Phosphorylation of Ser465 and Ser467 in the C terminus of Smad2 mediates interaction with Smad4 and is required for transforming growth factor-β signaling. Journal of Biological Chemistry. 272 (44), 28107-28115 (1997).
  39. Abdollah, S., et al. TβRI phosphorylation of Smad2 on Ser465 and Ser467 is required for Smad2-Smad4 complex formation and signaling. Journal of Biological Chemistry. 272 (44), 27678-27685 (1997).
  40. Petersen, M., et al. Oral administration of GW788388, an inhibitor of TGF-β type I and II receptor kinases, decreases renal fibrosis. Kidney International. 73 (6), 705-715 (2008).
  41. Gubelmann, C., et al. Identification of the transcription factor ZEB1 as a central component of the adipogenic gene regulatory network. Elife. 3, 03346 (2014).
  42. Nickel, J., Ten Dijke, P., Mueller, T. D. TGF-β family co-receptor function and signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 50 (1), 12-36 (2018).
  43. Mazerbourg, S., et al. Growth differentiation factor-9 signaling is mediated by the type I receptor, activin receptor-like kinase 5. Molecular Endocrinology. 18 (3), 653-665 (2004).
  44. Rebbapragada, A., Benchabane, H., Wrana, J. L., Celeste, A. J., Attisano, L. Myostatin signals through a transforming growth factor-β-like signaling pathway to block adipogenesis. Molecular and Cellular Biology. 23 (20), 7230-7242 (2003).
  45. Jonk, L. J., Itoh, S., Heldin, C. H., ten Dijke, P., Kruijer, W. Identification and functional characterization of a Smad binding element (SBE) in the JunB promoter that acts as a transforming growth factor-β, activin, and bone morphogenetic protein-inducible enhancer. Journal of Biological Chemistry. 273 (33), 21145-21152 (1998).
  46. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
  47. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  48. Gellibert, F., et al. Discovery of 4-{4-[3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H- pyran-4-yl)benzamide (GW788388): a potent, selective, and orally active transforming growth factor-β type I receptor inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (7), 2210-2221 (2006).
  49. Ishay-Ronen, D., Christofori, G. Targeting Cancer Cell Metastasis by Converting Cancer Cells into Fat. Cancer Research. 79 (21), 5471-5475 (2019).
  50. Gupta, P. B., et al. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell. 138 (4), 645-659 (2009).
  51. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), (2016).
  52. Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Research. 72 (6), 1384-1394 (2012).
  53. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-β type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).

Tags

Kreftforskning transformere vekstfaktor-β epitel-til-mesenchymal overgang brystkreft vestlig blotting transkripsjonsreporter immunofluorescence hemmere adipogenese

Erratum

Formal Correction: Erratum: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells
Posted by JoVE Editors on 12/15/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. NMuMG was mislabeled as cancer cells.

NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-β in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

Studere TGF-β signalisering og TGF-β-indusert epitel-til-mesenchymal overgang i brystkreft og normale celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Thorikay, M., van der… More

Zhang, J., Thorikay, M., van der Zon, G., van Dinther, M., ten Dijke, P. Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. J. Vis. Exp. (164), e61830, doi:10.3791/61830 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter